慢病毒载体的构建及低表达和过表达CEA EC9706细胞株的建立.pdfVIP

第 29卷 第 3期 河南 大学学报 (医学版) VoL29 No．3 2010年 8月 JournalofHenanUniversity(MedicalScience) Aug．2010 慢病毒载体的构建及低表达和过表达 CEAEC9706细胞株的建立 郑 红 ，林 波 ，赵 国强 ，董子 明 (1．河南大 学医学院 病理生理教研室，河南 开封 475004；2．郑州I大学 基础 医学院，河南 郑州 450052) 摘 要 ：目的：构建人癌胚抗原(CEA)慢病毒 siRNA和表达载体并包装成感染性病毒颗粒 ，获得稳定低表达和过 表达CEA的 EC9706细胞。方法：构建 CEA siRNA 载体 ：依据 siRNA靶序列设计原则，针对人 CEA的 cDNA序 列，设计并合成编码 siRNA的 3对寡核苷酸序列，克隆入 siRNA 载体 (pRNATU6．2／Ienti)中构建 3个重组体 pRNAT—U6．2-SCEA。构建 CEA表达载体 ：以人 CEA 的测序质粒为模板 ，PCR扩增 CEA全长 ，装入 pIenfiGFP 转移质粒 ，经过测序证实其序列与标准序列完全一致。然后进行重纽慢病毒分别感染 EC9706细胞 ，G418筛选得 到稳定感染细胞株 。分别用荧光定量 Real—timeRTPeR和 Westernblot检测 EC9706细胞 中CEA基 因表达抑制 或增强的效果。结果 ：EC9706病毒感染 48h后 荧光显微镜观察 CEA慢病毒载体在细胞 中高效表达 ，经过 RT- PCR和 Western—blot验证 ：得到 3株稳定 CEA低表达 的 EC9706细胞株 ，其 中一个 CEA 的表达几乎得到完全抑 制 ，1株稳定CEA过表达的EC9706细胞株 (EC9706CEA)。结论：建立 了稳定低表达和过表达CEA的EC9706细 胞株 ，成功调控食管癌 EC9706细胞 中CEA 的表达 ，为进一步从分子水平探讨 CEA的功能奠定 了基础。 关键词 ：癌胚抗原 ；EC9706；慢病毒载体 中图分类号：R73．3 文献标识码 ：A 文章编号 ：1672—7606(2010)03—0160—04 ConstructionoflentiviralvectorandestablishmentofstableEC9706eell lineswith lowerorhigherCEA expression ZHENG Hong ，LIN Bo ，ZHAO Guo—qiang ，DON (]Zi—m ine。 (1．Departmento／Pathoph，~iologY，Medic、a／Co／legeo．／HenanUniz，er _y，Kaifeng，Henan475004，China 2 Schoolo／BasicMedicalScience，Zhe．ngzhouUniversity，Zhengzhou，Henan450052，China) Abstract：Objective： ToconstructCEA siRNAvectorandCEAexpressionvector，topackagelentivirusparticles， andtoestablish stableEC9706celllineswith lowerorhigherCEA expression．M ethods： Construction ofCEA siRNA expression vector：according to theprincipleofdesigningsiRNA sequence，aimed athuman CEA eDNA sequence，threeDNA ohgonucle。tidesofshorthairpinRNA sequenceweresynthesized，threehairpinDNAswere clonedintosiRNA expressionvec{or(pRNAT-U6．2／Jcnti)．ConstruerionofCEA expressionvector