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国外检疫证 检疫目标确定 番茄溃疡病(Clavibacter michiganensis subsp.michigansis) 实验室检疫 1 了解病害初步信息 拉丁学名:Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis(Smith)Davis et a1. 英文名称: Bacterial canker and wilt of tomato 国内外分类:进境检疫对象 检疫分类: 病害 分类地位: 密执安棒形杆菌属于原核生物界(Procaryota),厚壁菌门(Firmicutes),棒形杆菌属(Clavibacter),密执安棒形杆菌密执安亚种 寄主名称: 自然寄主主要是番茄(Lycopersicon)、龙葵(Solanum nigrum)、裂叶茄(S.triflorum)和其他茄科杂草。接种寄主有:乳茄(S.mammosblm)、马铃薯(S.tuberosum)、醋粟番茄(L.pimpinellifolium)、树番茄(Cyphomandra betacea)、心叶烟(Nicotiana glutinosa)等,此外,还有小麦、大麦、黑麦、燕麦、向日葵、西瓜、黄瓜等。 分布地区: 番茄细菌性溃疡病首先在北美发现,目前分布于加拿大、美国(包括夏威夷)、墨西哥、多米尼加共和国、古巴、哥斯达黎加、巴拿马、格林纳达、瓜德罗普、马提尼克、哥伦比亚、秘鲁、巴西、智利、阿根廷;日本、印度、黎巴嫩、以色列;土耳其、挪威、芬兰、前苏联、前南斯拉夫、波兰、匈牙利、德国、奥地利、瑞士、荷兰、比利时、英国、爱尔兰、法国、葡萄牙、意大利、罗马尼亚、保加利亚、希腊;肯尼亚、突尼斯、摩洛哥、乌干达、赞比亚、马达加斯加、津巴布韦、南非;澳大利亚、新西兰、汤加。 2 挑选样品 皱缩、较小、发黑的种子,为可能带菌种子,种子的 带菌率只有1%,为了避免漏检,务必要对种子进行挑选 后检测。 3 确定检疫技术方案 标准方法:依据国家标准、进出口标准 非标方法:依据文献、实验室常用方法确定的检测方法 根据情况,确定检疫方案如下: 1 分离培养 2 免疫学检测 3 分子生物学检测 4 备选非标方法 直接PCR、免疫PCR、酶联免疫、免疫磁珠、膜过滤。 1 分离培养 将挑选的种子用1%次氯酸进行表面消毒,在超净工作 台中,将种子研碎,或者直接压实接种在普通PDA培养基 上,48h后观察结果。 2 免疫学检测 试剂盒说明书详解 3 PCR相关方法 设计引物 我们用得较多的引物设计软件有: Oligo 6.0 ( demo version) Primer premier 4.11 (www.P demo version) PCR引物设计的重要性 我们用得较多的引物设计软件有: Oligo 6.0 ( demo version) Primer premier 4.11 (www.P demo version) 引物在PCR反应中处于关键作用。而在目前DNA的化学合成技术非常成熟的情形下,引物设计是否合适是我们应更为关注的层面。 引物决定着扩增的特异性和扩增的效率。 引物设计影响到后续载体构建的效率 引物设计影响到实验的成本 引物设计原则 长度 顺序 碱基组成 二级结构 对3’-端的 要求 对5’-端的 要求 Tm值 PCR引物的寡核苷酸数(长度) 一般在16~30个核苷酸(NT) 至少为16个核苷酸 最好为20~24个核苷酸 以上指与模板链完全配对的碱基数 问题: 太短,特异性差; 太长,自身折叠形成二级结构;Tm过高,不利于与模板稳固配对,难以形成扩增起始二级结构。 引物顺序 应是所要扩增基因特异的顺序 若要进行个体间的比较,应选 择保守同一的顺序来设计引物 设计后用电脑DNA数据库检测 同源性 引物的碱基组成 GC为40~60% ATGC最好随机分布 问题: GC%太少扩增效果不佳 GC过多易出现非特异条带 避免成串的嘌呤和嘧啶 引物中的二级结构 一对引物的顺序不应自身互补 特别要避免3’-端的重叠,以免形成二聚体等特异的扩增条带 防止引物自身形成二级结构 对3’-端的要求 3’-端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格配对 若3’端最末的碱基不肯定,可用次黄嘌呤核苷取代的引物,因为 I 可与ATGC配对,这样可避免因末端碱基不配对而造成PCR失败 防止3’-末端发卡结构 、茎环结构 ! 对5’-端的要求 5’-端可附加一段与模板非互补的序列,可长至45NT,而不影响扩增,这点对研究基因结构与功能很有用。 一般在引物的5’-端可加入限制酶位点序列,以便进行克隆。在酶切位点5’-端还应加上适当数量的保护碱基极(如GCGC
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