成年大鼠脊髓损伤后Nestin与Bax基因表达相关性研究开题报告.docVIP

学号： 10660S090352 贵阳医学院 硕士研究生论文开题报告书 （科研型及临床型通用） （2011年度） 专 业 名 称 外科学(骨外) 培养类型 科研型 临床型 研究生姓名 指导教师姓名 教 研 室 外科 二级学院（系部） 研究生学院 填表日期： 2011年4月20日 填表说明 一、本计划书由研究生本人与导师共同协商填写，要求文字简明扼要，条理清晰。 二、本表一式四份，个人、教研室、系部、研究生部各留一份。 三、计划批准后非经同样手续不得随意更改。 研究课题的名称：成年大鼠脊髓损伤后Nestin与Bax基因表达相关性研究 研究课题的目的：1，研究成年大鼠脊髓损伤后，不同时期损伤脊髓组织中Nestin表达情况。2，探索脊髓损伤后基因Bax不同时期的表达情况.进而研究Bax基因的表达与神经干细胞反应增生的相关性。为探讨和完善神经细胞凋亡的分子机制以及脊髓损伤后的自身修复机制提供更充分的理论依据。 学位论文的类型（√）： 1 基础研究（ ） 2 应用基础（√） 3 应用研究（ ） 4 其 他（ ） ─1─ 国内外研究情况简介：脊髓损伤(Spinal cord injury,SCI)是。SCI的传统治疗方法有脊柱骨折脱位的复位固定、解除压迫、对症、预防并发症及功能康复锻炼治疗。近年来,随着神经病理生理及神经发育学研究的不断深入,神经组织不能再生的传统观念受到了挑战。尤其是神经干细胞(Neural stem cells,NSCs)的发现和证实,为治疗包括脊髓损伤在内的难治性中枢神经系统(Centerneural system,CNS)疾病开辟了新的道路。正常成年脊髓靠近中央管的室管膜与室管膜下区和白质实质存在内源性神经干细胞,脊髓损伤后内源性神经干细胞被活化并增殖和迁移到损伤区。大部分内源性神经干细胞分化成星型胶质细胞和有助于再髓鞘化的少突胶质细胞,而不是神经元。对内源性神经干细胞的定向分化调控是治疗脊髓损伤的关键问题也是目前尚未解决的难题。 健康成年Wistar大鼠30只，雌雄不限。随机分为两大组：假手术组(sham组，n=4)和脊髓损伤组(SCI组，n=26)。SCI组按存活时间不同分为2h、4h、8h、24h、3d、7d组，每个时间点4只动物。 4.2 SCI实验动物模型制作 脊髓损伤组(SCI组)用10%的水合氯醛对大鼠经腹腔进行麻醉，备皮，常规消毒，铺无菌手术洞巾；以T10为中心，沿脊柱方向取一长约2.0cm的切口，切开皮肤、肌肉，分离并显露棘突，游离附着于棘突两侧的骶棘肌，将T10椎板全部切除，保留硬膜。在显微镜帮助下用宽度1.2 mm，压迫力约为98牛顿（N）的动脉瘤夹压迫脊髓3min致脊髓损伤。假手术组(sham组)不做任何处理。术后人工按压膀胱协助排尿每日2次。 4.3 组织标本的采集 动物到达存活时间点后，依不同的实验分组，将大鼠腹腔麻醉，在无菌条件下从脊髓损伤部位远端取1cm的脊髓两份组织。分别梯度脱水，石蜡包埋，制备5μm组织切片。 4.4 Nestin、Bax免疫组化染色及图像分析 免疫组化染色采用Powervision二步法进行。切片脱蜡水化，柠檬酸缓冲液进行抗原修复，3%的H2O2封闭内源性过氧化酶。染色: PBS洗3次，每次2 min，加一抗nestin(1: 500稀释) 、鼠抗人Bcl-2单克隆抗体，室温60 min；PBS洗3次，每次2 min；加1滴检测试剂，室温30min，PBS洗3次，每次2 min；DAB显色5-10 min；苏木素复染，脱水，封片。对照组用正常山羊血清(1: 50)代替一抗，其余同前，以检验上述免疫组化染色的特异性，其结果均为阴性。 图像分析采用NIH图像分析软件对nestin、Bax表达阳性的区域进行统计(单位:μm2)，应用数码照相技术在放大400倍的光学显微镜下对中央管区和灰质区进行拍照，总共拍出100张中央管区和100张灰白质区照片。定量分析由未参与本实验的两位工作人员进行分析统计。 4.5 统计学处理 实验数据用均值±标准差(±s)表示，采用SPSS13.0统计分析软件进行单因素方差分析，差异显著性水平取P0.05，差异非常显著性水平取P0.01。组间比较选用t检验，P0. 05为差异具有显著性。 ─4─ 研究进度及具体时间安排： 2011年6月——2011年7月：实验用品准备工作及试剂购买。 2011年8月——2011年10月：动物实验，包括动物模型的建立、动物饲养和脊髓标本提取。 2011年11月——201