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实验三 外界因素对细菌的影响 第三周 实验内容 物理消毒灭菌法 化学因素和生物因素对细菌的影响 目的要求 熟悉紫外线对细菌的杀灭作用。 初步掌握细菌对常用抗菌药物和化学消毒剂敏感性测定的方法。 了解实验室常用灭菌器的使用方法。 一、紫外线对细菌的杀灭作用 【原理】 紫外线中波长为200～300nm者具有杀菌能力。其中265～266nm的杀菌作用最强，紫外线除日光中含有一部分外，医学上使用的常以人工紫外线灯产生；其杀菌机制是干扰细菌DNA的合成。特点是穿透力较弱。 【材料】 1.菌种：大肠杆菌18～24小时肉汤培养物，枯草杆菌24～48小时肉汤培养物。 2.培养基：普通琼脂平板。 3.灭菌的三角形纸片、镊子、紫外线灯。 【方法】 1．用接种环沾取大肠杆菌和枯草杆菌培养物数环，分别在两只琼脂平板培养基表面来回密密涂满整个平板。 2．以镊子在火焰上迅速通过2～3次杀灭其表面杂菌后，镊取三角形灭菌纸片两张，各放一张在每一琼脂平板表面的中央。 3．打开两皿皿盖，在离水银灯约1米处，直接受紫外线照射30分钟后，以镊子取出纸片，将纸片投放消毒缸内，盖好皿盖，37℃孵育24小时后观察生长情况。 观察记录结果 二、常见化学消毒剂的杀菌作用 【材料】 1．菌种：葡萄球菌、大肠杆菌18～24小时肉汤培养基。 2．培养基：琼脂平板。 3．0.1％新洁尔灭、1％龙胆紫、2％ 碘酒、 2％红汞、6.5毫米直径的灭菌滤纸圆片、镊子。 【方法】 1．分别以接种环沾取葡萄球菌或大肠杆菌培养物数环，作来回连续划线，使密密涂满于两只琼脂平板培养基表面。 2．以镊子夹取灭菌圆形滤纸小片各两张，分别浸于消毒剂内，再一一取出，并令纸片与试管内壁接触，去除多余药液后，分别放在已种有细菌的琼脂平板表面的中央及四周，各纸片间的距离要大致相等（图3-2）。 平板纸片法示意图 3．37℃孵育24小时，观察各消毒剂纸片周围有无抑菌圈，比较各抑菌圈的大小。 观察记录结果，并比较不同细对相同化学消毒剂的敏感性以及同一细菌对不同化学消毒剂的敏感性。 三、细菌对常用抗生素的敏感度测定 以滤纸圆片浸沾一定稀释度的药物，贴附于已涂满被测细菌的琼脂平板培养基上，孵育后，因药物的抑菌作用及渗透性，纸片周围可以有抑菌圈出现，据根抑菌圈的有无和大小，以测知该菌对这些药物的敏感性，但准确度不如试管法。 【材料】 1．菌种：金黄色葡萄球菌，伤寒杆菌18～24小时肉汤培养物。 2．培养基：普通琼脂平板。 3．各种抗生素及磺胺药的干燥滤纸小圆片 【方法】 1．分别将金黄色葡萄球菌及伤寒杆菌密布于两只琼脂平板表面。 2．每一种细菌的琼脂平板上，分别放置磺胺药、青霉素、链霉素、氯霉素和金霉素的干燥药物滤纸圆片，各片间距要相等。 3．37℃孵育18～24小时后，观察抑菌圈的有无及大小。 培养后平板上出现大小不等的抑菌圈 观察记录结果 按表3-1 抑菌环解释标准 来判读细菌对各种抗生素的敏感度。 四、常用消毒灭菌器与滤菌器 （一）煮沸消毒器： 煮沸消毒器是用金属制成的有盖长方形锅，锅内有一带孔的盘，底部有电热装置。 用途：消毒注射器及解剖器械等 煮沸消毒器： （二）高压蒸汽灭菌器 1．构造：高压蒸汽灭菌器是一个双层的金属圆筒，两层之间盛水，外层坚厚，其上或前方有金属厚盖（见图3-4）。盖旁附有螺旋，借以紧闭盖门，使蒸汽不能外溢，因而蒸汽压力升高，随着其温度亦相应的增高 高压蒸汽灭菌器(手提式） 2．用法：加水至器内，放入被灭菌物品，将器盖盖上，螺旋转紧使之密闭。器下用煤气或电炉等加热，同时开排气阀门，使器内冷空气完全逸出，否则压力表上可示压力并非全部蒸汽压力，灭菌将不完全。 横卧式高压蒸汽灭菌器剖面图 3.用途：高压蒸汽灭菌为最可靠方法，凡耐高热的潮湿的物件，如培养基、生理盐水、衣物、 纱布、棉花等敷料、玻璃器材、传染性污物及细菌培养物等都可用本法消毒灭菌。 （三）干热灭菌器 干热灭菌器（干烤箱）是由双层铁板制成的长方形或正方形金属箱，外壁内层装有隔热的石棉板。在烤箱中装置电热线圈，上有小孔，按插温度计供通空气用，箱前有铁门及玻璃门，箱内有金属板架数层，电热烤箱的前下方装有温度调节器，可以保持所需的温度（见图3-5）。 电热恒温干烤箱示意图 【用法】 培养皿、吸管、试管等玻璃器材包装后放人箱内，闭门加热，当温度上升至160～170℃时，保持2小时。到达时间后，停止加热，待温度自然下降至40℃以下，方可开门取物，否则冷空气突然进入，易引起玻璃炸裂，且热空气外溢，往往会烧伤取物者的皮肤。一般吸管、试管、培养皿、凡士林、液体石蜡等用本法灭菌。 （四）滤菌器 滤菌器使用时的