BGC-823细胞中慢病毒途径针对HIF-1α基因的RNAi实验.pdfVIP

第29卷 第3期 江 西 科 学 V01．29No．3 2011年6月 JIANGXI SCIENCE Jun．2011 文章编号：1001—3679(2011)03—0329—06 BGC一823细胞 中慢病毒途径针对 HIF一1o【基因的RNAi实验 毛竹君，魏品康，武 峰，张慈安，孟先泽，赵 婧，赵圣佳，张 璇，陆 烨 (上海长征医院中医科 ，上海 200003) 摘要：目的：构建人HIF—let基因的shRNA慢病毒载体、包装生产重组慢病毒颗粒，病毒途径高效感染 胃癌细 胞株BGC-823，并验证基因沉默效率。方法：在NCBI数据查找人HIF．1a基因序列，然后使用siRNA在线设计 软件，设计针对基 因CDS区的3条siRNA序列及Negative序列。根据设计好的siRNA序列设计双链互补的 shRNAO·ligoDNA，退火形成双链后与线性化载体链接 ，构建shRNA重组表达载体。经由293TN细胞包装 shRNA重组慢病毒颗粒，随后使用重组病毒感染BGC一823，通过荧光标记蛋 白GFP确定感染效率后收集细胞 样本，分别采用Real-timePCR和 Westernblot方法检测靶基 因在 mRNA和蛋 白质水平的沉默效率。结果： shRNA重组表达载体测序结果与设计序列完全一致，包装病毒后滴度达到1×10ifu／L 慢病毒感染 BGC． 823细胞取得 了极高的基因转导效率。mRNA检测结果显示，siRNA3对于对与 目的基因的沉默效果最好，较 阴性对照序列组相比较，mRNA的表达量下降了92％，Westernblot检测的结果与mRNA检测结果完全相符 合。结论：通过慢病毒途径，可以在BGC．823细胞中高效的进行HIF．1et基因的沉默。 关键词：HIF．1et；慢病毒；RNAi；BGC-823 中图分类号 ：Q782 文献标识码：A RNAiofHⅡ-laGeneinBGC ·823CellsthroughLentiviralApproach MAOZhu-jun，WEIPin—kang，WUFeng，ZHANGCi—an，MENGXian—ze， ZHAOJing，ZHAOSheng-jia，ZHANGXuan，LUYe (DepartmentofChineseMedicine，ShanghaiChangzhengHospital，Shnaghai200003PRC) Abstract：Objective，ToconstructshRNAlentiviralvectortargetedtohumanHIF-letgene，topack— ageandproducerecombinantlentivirialparticles，infectagastriccancercelllineBGC一823efficient— ly，and to verifytheefficiencyofgenesilencing．Mehtods：htegenesequenceofHIF—lotwas searched inNCBIdatabase，andonlinesiRNA designsoftwarewasusedtodesign threesiRNA se— queneestargetedgeneCDSregionandaNegativesequence．Double—strandedcomplementaryOligo DNA sequencesfordesingedsiRNA sequencesweredesigned，nadannealedtoofrm doublestrands， andlinkedtolinearvectortoconstructrecombinantshRNA expressionvector．293TN ceilswereused ofrshRNA lentiviralparticlepa