人上皮细胞β防御素3基因真核表达载体的构建及鉴定.pdfVIP

Apr．2008，Volume2，No．4 (SerialNo．5) JournalofLifeSciences，ISSN1934-7391，USA 人上皮细胞 p防御素 3基因真核表逵载髓的横建及鉴定 丁 辉 ，到重诚 (首都酱科大孥附属北京免童普院免科研究所，北京 100045) 摘 要：目的 耩建人 3-防御素 3的真核表遣载髓，属今後蚌染真核细胞，研究 一防御素 3基因的功 能奠定一定的基磋。方法 髓外基因合成人 D一防御素 3的 (hBD3)基因片段，并克隆入 PcDNA3．1的载 髓中，经酶切及测序鉴定。结果 耩建的真核表遣载髓鲤酶切鉴定袅突燮凳生。结 成功地耩建 了 PcDNA3．1一hBD3真核表逵载髓。 网键匍：HBD3；真核表连载醴；蒋染 抗菌肽是横髓局抵御外源性病原微生物的入 根掾 GenBank鞭道的hBD一3的cDNA序列毅 侵而麈生的一颓小分子多肽 ，舆傅统的抗生素相 比 一 封引物，以反蒋绿廑物届模板 ，采用 pfuTaq 具有分子量小，抗菌 庸，熟稻定性好，抗菌楼理 高保真酶 (天属畴代)连行 PCR反虑。引物由奥 猬特等傻黠¨J。防御素是抗菌肽中的一颓 ，它们是 科 公 司合 成 ，其 序 列 局 ：hBD一3 上 游 ： 由真核细胞基因编码的肽颊抗菌分子，依攘其在基 5-ATGACT ! △ AGCTGTGGCTGGAACCTF 因和肽分子眉面上的结横特徵，防御素可 以分焉 3 TA，hBD一3下游 ：5’．TCAGTCAAGCTTTCTCG ， 即0【、13和0一防御素，我们所研究的hBD3是 6 TCA1．GT]rrcAGGG]r]rr。引物 5’端加上 XhoI酶切 防御素的一棰 ，hBD3的分子结槽和其他 p防御素 位黠，并毅 ATGACT保遴碱基，3’端加上HindIII 基因相似 ，它的mRNA全畏局 33lbp，有雨倜外颞 酶切位黠，并毅 TCAGTC作餍保鼗碱基 。PCR 子，表连蛋 白的分子量属5kD左右。它在保鼗上皮 髓系局 ：10xPCR缓衡液 2．5gl，dNTPs0．5gl，上下 细胞和粘膜免受感染起着屏障防御的作用，具有唐 游引物各0．5gl，cDNAlgl，pfuTaq高保真酶 1“1， 措抗微生物活性，包括抗细菌、真菌、螺旋髓、病 高壁去雄子水禧充反鹰髓稹至25pl。按以下程序造 毒等 】，甚至可能在膻瘤的骚生 中具有一定的作用。 行 PCR 反虑 ：94℃ 5min；94℃30s，59℃30s， 72℃45s，31佃循璨；72℃ 10min延伸。廑物在 1．0 1．材料和方法 ％理脂糖凝腭上霞泳。 腭上切下含 目的片段的鼋 泳僚带，用弑剖盒回收，按使用税 明耆造行操作 。 1．1材料 1．2．2回收麈物及载髓蔓酶切 ，再 回收 1．1．1菌株，耍粒和上皮绌胞 cDNA，DH5a感 酶切 片段 (包括 目的基 因 hBD一3及 载髓 受憋宿主菌 (本寅聆室保存)。PcDNA3．1真核表 PcDNA3．1)16gl，BufferB2pl，XhoIlpl，HindlII 连载髓赙于Novagen公司，食道上皮细胞 cDNA(本 1l，酶切髓系局 20pl，37~C水浴，遇夜。廑物在 寅腧室保存 ) 1．O％理脂糖凝腭上鼋泳。用弑剂盒 回收，按使用税 1．1．2弑剂和酶 限制性 内切酶 、T4DNA连接