刺糖多孢菌菌株遗传改良研究.pdf

分类号 密 级 学校代码 10542 学 号 刺糖多孢菌菌株遗传改良的研究 Geneti oI citenejsyloporaImlImprovementhccaS’。tnem! splnosa 研究生姓名 易卓 指导教师姓名、职称 夏立秋教授 学 科 专 业 微生物学 研 究 方 向 应用微生物 湖南师范大学学位评定委员会办公室 二零一二年六月 flI|IllI II I IIII IIIIJlJIIIf 摘要 ＼2148438 新型的微生物源杀虫剂多杀菌素是由放线菌刺糖多孢菌 (Saccharopolysporaspinosa)经有氧发酵后产生的一种胞内次级代谢产物。 因其对农业害虫有着极好的杀虫效果，而对哺乳动物、鱼类、鸟类和大多 数益虫具有极高的安全界限，兼具化学农药的高效性与生物农药的安全性， 正成为最具发展前景的新一代杀虫剂。但其产量低下，且发酵周期长达二 至三周，使得生产成本极高，严重制约了其生产及实际应用。因此，进行 菌种改良，以尽可能地提高多杀菌素产量，成为了开发该种杀虫剂最迫切 需要解决的问题之一。传统的理化诱变和筛选虽然有效，但有工作量大并 且不能定向等缺陷。本研究尝试从原生质体融合和启动子替换两方来提高 多杀菌素产量。 erythraea)NRRL 糖多孢菌(Saccharopolysporaspinosa)SP0608 基因和2．7kb的玷矽以基因片段(spnA基因起始模块的一部分)。 2338接合转移。培养若干天后，挑取转化子在含有适宜 erythraea)NRRL 产红霉素的红色糖多孢菌——红色糖多孢菌D。经过根据阿伯拉霉素抗性 基因设计的引物的PCR分析，红色糖多孢菌D的分子核酸特征得到了验 证。将红色糖多孢菌D进行固体平板培养，进行形态观察，发现其产色素 的量较原始菌株红色糖多孢菌NRRL2338多；将红色糖多孢菌D进行摇 T 瓶发酵培养，HPLC检测其已经不产红霉素。 将红色糖多孢菌D和刺糖多孢菌SP06081分别培养制备原生质体， 然后融合。随机挑取再生平板上80个菌落经加有适宜浓度阿伯拉霉素的 固体平板转接培养两次后，分别摇瓶发酵培养，HPLC检测菌株产多杀菌 素情况，得到4株产多杀菌素的融合菌株。取融合菌发酵液HPLC收集峰 液做质谱分析，进一步证实融合菌株产生多杀菌素。 基于4株融合菌株多杀菌素产量都不及起始菌株高，我们接着采用不 加抗生素直接筛选的方法，成功筛选到若干高产多杀菌素的融合菌株，其 1％。后续 中菌株B．2多杀菌素产量提高最为明显，较原始菌株增加了33 传代培养表明融合菌株B一2多杀菌素产量稳定，遗传稳定性较好。 PCR产物双酶切之后然后与载体pLSB2连接，构建了刺糖 将tspnA 操作。 本文对红色糖多孢菌和刺糖多孢菌原生质体融合进行了研究并且成 功提高了多杀菌素的产量，这为具有优良发酵特性的红色糖多孢菌和刺糖