禽流感病毒H5、H7和H9亚型基因的引物设计与多重RT—PCR扩增.pdfVIP

江苏农业科学 2008年第6期 禽流感病毒 H5、m 和H9亚型基因的引物设计 与多重 RT—PCR扩增 张文慧 ，王伟利 ，刘 明 ，钱爱东 (1．吉林农业大学，吉林长春 1301l8；2．吉林出入境检验检疫局，吉林长春 130062； 3．中国农业科学院哈尔滨兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江哈尔滨 150001) 摘要 ：PCR技术是分子生物学领域最基本也是最重要的技术手段之一。然而，找到一对合适的核苷酸片段作为引物 ，使其有效地 扩增模板 DNA序列，决定着PCR的成败。在 GENEBANK中搜索 H5、H7和 H9亚型禽流感病毒的血凝素基因序列，并利用DNAStar软 件分析它们的同源性，利用 PrimerPremier5．0软件进行引物设计。多重 RT—PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳结果显示引物设计成功。 关键词：禽流感病毒；引物设计；多重RT—PCR 中图分类号：$851．347．201 文献标志码：A 文章编号：1002—1302(2008)06—0069—02 自从 1985年美国PE—Cetus公司的人类遗传研究室 2：AM087222 Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应 (PCR)以 Influenza A virus (A／mallard／Germany／WV1349／03 来 ，PCR已经成为分子生物学领域最基本也是最重要的技术 (H5))partialHA geneforhemagglutiningiembl 手段之一…。1878年首次报道意大利鸡群暴发一种严重疫 AM087222．1I 病，当时称为 “鸡瘟”。1955年证实该病病原是A型禽流感病 点击AM087222打开，便可获得一个 H5亚型AIV的基 毒，该病为高致病性禽流感 。RT—PCR作为一种现代分子 因序列资料。 生物学基因诊断技术，具有高度敏感性和特异性，并可大大缩 经查找，最后选定47个H5亚型、4J4个H7亚型和 45个 短禽流感病毒(AIV)的检出时间，能在数小时内检出痕量病 H9亚型毒株的血凝素基因序列。 原，克服了传统的AIV诊断技术包括病毒分离鉴定试验周期 1．2．2 设计引物 长的缺点，为AIV早期快速诊断提供了敏感、快速、实用的方 1．2．2．1 序列同源性分析 打开DNAStar，点击 MegAlign， 法 。RT—PCR成功的关键是引物的设计。本试验对运用 在File菜单中选择EenterSequences，在查找范围对话框中将 PrimerPremier5．0软件设计 H5、H7和 H9亚型AIV的多重 上述获得的}{5所有毒株的序列复制过来，点击 done，就 自动 RT—PCR引物进行了探讨。 将输入的所有序列进行 比较，分析同源性，确定同源性的区 域。找出同源性较高的区域 ，在此区域内选择出引物设计的 1 材料与方法 模板。经软件分析，H5亚型在 1—1030碱基范围内、H7亚 1．1 材料 型在 1～800碱基范围内、H9亚型在 1—1200碱基范围内同 1．1．1 试验用软件 PCR引物设计软件为PrimerPremier 源性都很高。 5．0和 DNAStar。 1．2．2．2 引物设计 以DQ997325毒株为例设计引物。打 1．1．2 试验用毒株 禽流感病毒 I{5、H7和H9亚型毒株，由 开PrimerPr