Loxp突变体的筛选与应用.pdfVIP

维普资讯 高技术通讯 2004．11 Loxp突变体的筛选与应用① 刘维一② 汪亚平 朱作言③ (中国科学院水生生物研究所淡水生态与生物技术国家重点实验室 武汉430072) 摘 要 Cre／loxp系统已成功应用于多种生物的遗传改造，并成为研究基因功能的有力 工具之一。由于野生型 loxp之间重组反应的可逆性，Cre／loxp系统在基因激活／灭活、基 因打靶、基因精细修饰等方面的应用受到了极大的限制，而loxp突变体的出现解决了这 一 难题。本文就loxp突变体的筛选与应用作了系统全面的介绍。 关键词 Cre／loxp，loxp突变体，基因打靶 内外重组反应分析表明，相对于野生型 loxp而言， 0 引 言 lox71和 lox66被Cre识别的效率有所提高，而 lox75， Cre／loxp系统是源于大肠杆菌 P1噬菌体的一 lox76，lox44以及 lox43被 Cre重组酶识别的效率大 个位点特异性重组体系 j。Cre重组酶所识别并催 大下降，故Lox71和 lox66可以作为一对理想的左右 化的特定 DNA序列称为 loxp(1ocusofcrossoverxin 突变体应用于基因打靶研究中。 P1)，包含两个 13bp的反向重复序列和一个 8bp的 1．2 中心(spacer)突变体 间隔序列(spacerregion)，这个非对称的8bp间隔区 为了研究loxp间隔序列在重组反应中的作用， 决定着 loxp的方向ll，。Cm／loxp系统在基因功能 Lee等[j人工合成了24个单碱基替换和30个双碱基 鉴定、染色体易位和删除、转植基因在生殖细胞中的 替换的中心突变体。然后利用纯化的Cre重组酶在 删除等方面应用非常广泛[ 。由于Cre重组酶催 体外分别试验这54个中心突变体与野生型loxp之间 化两个野生型 loxp之间的重组反应是可逆的，最终 的重组效率，以及它们 自身发生重组反应的效率。结 重组反应达到一个动态平衡 ，当野生型 loxp应用 果发现间隔序列8bp中的第 1和第8个碱基发生改 于外源基因定点整合、基因捕获、基因精细修饰等研 变后不太影响重组反应的效率，而其他绝大多数中心 究时，重组效率常常很低，而 loxp突变体的出现则 突变体不与野生型loxp发生重组，表明间隔序列8bp 为解决这一难题提供了有力工具。 中的第 2到第 7个碱基在重组反应中起到了决定性 l Loxp突变体的筛选 的作用。这个实验结果也在一定程度上支持了Guo 等提出的关于Cm／loxp重组反应的Houidav模型n【J： 1．1 左右(LE／RE)突变体 间隔序列的第7个碱基影响着第一步链的断裂，间隔 A]~rt等根据 FRT突变体的原理设计了 3对 序列的第 3～6个碱基影响着Holliday异构化时链交 loxp突变体：lox71和 lox66、lox75和 lox76、lox44和 lox43[引 换的进行，间隔序列的第 2个碱基影响着第二步链的 。