崂山奶山羊瘤胃微生物总DNA提取方法的优化.pdfVIP

中国蓉亏c童攉 2009，25(05)：18—21 ChineseAgriculturalScienceBulletin 崂山奶山羊瘤 胃微生物总DNA提取方法的优化 隋昶生，王利华 (青岛农业大学动物科技学院，山东青岛266109) 摘 要：对瘤 胃微生物总DNA提取方法进行了改进，将冻融法和CATB法相结合，可以将细菌、真菌和古 细菌在 内的各种微生物的细胞壁充分的粉碎 ，且DNA提取效果稳定，可以获得足够大的DNA片段 (23kb)，可以满足后续试验的需要 。 关键词 ：总DNA；冻融法；CATB 中图分类号：S8．0 文献标识码 ：A ExtractionM ethodOptimizingofTotalDNA inRumenM icroorganism ofLaoshanDairy SuiChangsheng，WangLihua (QingdaoAgriculturalUniversity,AnimalScienceandTechnologyCollege，QingdaoShandong266109) Abstract：ThepresentexperimentwasconductedtoassessDNA extractionmethodofrfeezing-thawingand methods combined rfeezing-thawing and CATB．Results showed that the methods combination of rfeezing——thawingandCATB could smash cellwallofvarietiesofmicro——organismsincludingbacteria and Fungus．DNA extractionwasstablebythistechniqueandDNArfagmentswerelargeenoughtobeappliedin follow—uDresearch．Itcouldbeconcludedthatrfeezing—thawingandCATBmethodscombinationcouldextract thetotallumenmicrobialDNA． Keywords：totalDNA，freezing—thawingmethod，CATB 自Marmury1961年建立用十二烷基磺酸钠(SDS 细菌，其覆盖范围相对较窄”，第三种方法应用较为广 和氯仿从生物细胞中分离提取DNA样品的经典方法以 泛，已被多为研究者采用 。此试验是将将冻融法和 来，人们一直在探索能制备高纯度和高完整性的DNA CATB法相结合，探讨获取总DNA的效果。 制品的最佳方案。目前报道的瘤胃微生物的DNA提取 1材料与方法 方法有十二烷酞一肌氨酸／蛋白酶K裂解法、反复冻融+ 1．1材料 SDS／蛋白酶K裂解法和玻璃珠破碎法。十二烷酞…肌 瘤胃内容物取 自装有永久性瘤 胃瘘管的崂山奶山 氨酸／蛋 白酶K裂解法，是用终浓度含2％的十二烷酞一 羊。引物 由宝生物工程(大连)有限公司合成，引物序 肌氨酸和2mg／ml蛋 白酶K的缓冲液裂解细胞抽提其 列如下表1。DNA纯化试剂盒购于宝生物丁程 (大连) 总DNAt”。反复冻融+SDS／蛋 白酶K裂解法口，是将样 有限公司。 品与抽提缓冲液混合后在．80和65℃间反复冷冻．消 1．2 方法 融，使细胞壁裂解，然后用SDS和蛋白酶K处理获得总 1．2．1瘤 胃内容物的采集与处理 试验当曰经瘤胃瘘管 DNA。玻璃珠破碎法是利用机械力破坏细胞壁暴露 从山羊的瘤 胃腹囊下部搅动抽取瘤 胃内容物，放入充 DNAt。第二种所获得的总DNA所包含的微生物较为 满二氧化碳的离心管中，离心管充满后盖严管盖，迅速 广泛