离心机对植物组织蛋白质的提取一、植物组织蛋白质提取方法.pdfVIP

离心机对植物组织蛋白质的提取 一、植物组织蛋白质提取方法 1、根据样品重量(1g样品加入 3.5ml 提取液，可根据材料不同适当加入)，准备提取液 放在冰上。 2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置(3-4 小时)。 3、用离心机离心 8000rpm，40min，4℃或 11000，rpm，20min，4℃。 4、提取上清夜，样品制备完成。 蛋白质提取液：300ml 1、1Mtris-HCl(PH8) 45ml 2、甘油(Glycerol)75ml 3、聚乙烯吡咯烷酮 6g 这种方法针对 SDS，垂直板电泳！ 二、植物组织蛋白质提取方法 (summer) 三氯醋酸—丙酮沉淀法 1、在液氮中研磨叶片 2、加入样品体积 3 倍的提取液在-20℃的条件下过夜，然后离心 (4℃8000rpm 以上 1 小 时)弃上清。 3、加入等体积的冰浴丙酮(含 0.07%的 β-巯基乙醇)，摇匀后离心(4℃8000rpm 以上 1 小时)，然后真空干燥沉淀，备用。 4、上样前加入裂解液，室温放置 30 分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心 (15℃8000rpm 以上 1 小时或更长时间以没有沉淀为标准)，可临时保存在 4℃待用。 5、用Brandford 法定量蛋白，然后可分装放入-80℃备用。 药品： 提取液：含 10%TCA 和 0.07%的 β-巯基乙醇的丙酮 裂解液：2.7g 尿素 0.2gCHAPS 溶于 3ml 灭菌的去离子水中(终体积为 5ml)，使用前再加 入 1M 的DTT65ul/ml。 这种方法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特点！当然单向电泳也同样适用，只是 电泳的条带会减少！ 三、 组织：肠黏膜 目的：WESTERN BLOT 检测凋亡相关蛋白的表达 应用 TRIPURE 提取蛋白质步骤： 含蛋白质上清液中加入异丙醇： (1.5ml每 1mlTRIPURE 用量) 倒转混匀，置室温 10min 离心：12000 g，10min，4 度，弃上清 加入 0.3M 盐酸胍/95％乙醇：(2ml每 1mlTRIPURE 用量) 振荡，置室温 20min 离心： 7500g，5 min，4 度，弃上清 重复 0.3M 盐酸胍/95％乙醇步2 次 沉淀中加入 100％乙醇 2ml 充分振荡混匀，置室温 20 min 离心： 7500g，5min，4 度，弃上清吹干沉淀 1％SDS 溶解沉淀 离心：10000g，10min，4 度 取上清-20 度保存 (或可直接用于 WESTERN BLOT) 存在的问题：加入 1％SDS 后沉淀不溶解，还是很大的一块，4 度离心后又多了白色沉定， SDS 结晶？测浓度，含量才 1mg/ml 左右。 解决：提蛋白试剂盒，另外组织大小适中，要碎，立即加 2X BUFFER，然后煮 5－10 分 钟，效果很好的。 四、 植物材料：水稻苗，叶鞘，根 1、200 毫克样品置于冰上磨碎 2、加 lysis buffer，离心，10000rpm，4 度，5min 取上清 3、重复离心 5min lysis buffer：urea np-40 ampholine 2-me pvp-40 五、 蛋白质样品制备(sigma) 秧苗蛋白质样品的提取按 Davermal 等(1986)的方法进行。 100mg 材料剪碎后加入 10mgPVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂，用液氮研磨成粉， 加入 1.5 ml 10% 三氯乙酸 (丙酮配制，含 10mM 即 0.07%β-巯基乙醇)，混匀，-20℃沉 淀 1 小时，4℃，15000 r/min 离心 15 min，弃上清，沉淀复溶于 1.5ml 冷丙酮(含 10 mMβ- 巯基乙醇)，再于-20℃沉淀 1 小时，同上离心弃上清，(有必要再用 80％丙酮(含 10 mMβ- 巯基乙醇所得沉淀低温冷冻真空抽干。 按每 mg 干粉加入 20μl(可调) UKS 液[9.5 M尿素，5mM 碳酸钾，1.25%SDS，0.5%DTT(二 硫苏糖醇)，2% Ampholine (Amersham Pharmacia Biotech Inc，pH3.5-10)，6% Triton X-100]，37℃温育 30min，期间搅动几次，28 度 (温度低，高浓度的尿素会让溶液结 冰)16000 r/min 离心 15 min，离心力越大时间长一点越好！上清即可上样电泳。或者 -70 度保存 六、 植物根中蛋白质的抽取 (phenol) (1) sample, 液氮研磨 (2) 装 1.5 ml centrifuge 用