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遗传重组微生物的环境监测 张霞1*, 陈中义 2 , 张杰 2 , 宋水山 1, 李国勋 3 (1.北省生物所，石家庄 050051 ；2. 中国农科院植保所植物病虫害生物学国家重点实验室， 北京 100094；3.莱阳农学院，青岛 266109) 摘要：遗传重组微生物(GMM)的环境监测作为生物安全性评价的重要内容之一，正越来 越得到广大科研工作者的密切关注。本文综述了目前遗传工程菌和重组 DNA 的环境监测 的 主要方法。一是基于培养的方法，包括利用选择性培养技术，报告基因，基因探针和 PCR， 免疫监测等 ；一是基于免培养的方法 , 包括显微镜观测法 ，荧光原位杂交技术(FISH)，基于 直接提取微生物总 DNA 的分子生物学方法等。重点介绍了目前常用的几种报告基因和基于 直接提取总 DNA 的 DGGE/TGGE 方法，同时指出我国应加强 GMM 遗传监控的分子生物学 方法的研究及应用。 关键词：遗传重组微生物(GMM)；生物安全；监测方法 遗传重组微生物(Genetically modified microorganism, GMM)的环境监控主要包括：一 是监测遗传工程菌在环境中的生存，种群建立，在植物根系定殖能力以及重组 DNA 在土壤 土著微生物中的转移；二是监测遗传工程菌释放后对环境的潜在冲击，主要指环境微生物群 体结构（分类）的变化和代谢类型的变化[1] 。利用遗传工程菌本身所带有的许多特性例如抗 性、生物发光、标记基因、启动子序列等均可对其进行监测。 1997 年，Mahaffee 等对环境 释放后荧光假单胞菌的检测方法进行了研究。结果发现：采用平板计数得到的 GEM-8 和 R34 的数量大大低于野生菌株 89B-27 的数量，也低于 GEM-8 和 R34 用 IFC 法检测的数量。表 明传统 的标记容易低估环境中的微生物数量，从而推测也可低估活体微生物及植物定殖微生 物的数 量[2] 。这也从另一个侧面提示 ，分子检测有可能更准确 的反映 出工程菌的数量。 目前对于遗传工程菌和重组 DNA 的环境监测主要采用培养法或免培养法。 1. 基于培养的监测方法 1.1 利用选择性培养基监测 GMM 1.1.1 根据 GMM 上带有的特殊抗生素特性 , 如卡那霉素 （Kanamycin, Kan）、壮观霉素 （Spectinomycin, Spc ）、潮霉素 （Hygromycin B ）等抗生素基因，抗重金属等特点采用相应 [1] 培养基进行筛选，将减小背景干扰 ，从而增加监测的可能性 。 1.1.2 营养底物利用基因：甘露糖-6-磷酸异构酶基因(Mannose-6-phosphate isomerase, MPI)是 1999 年报道 的选择基因，其编码产物可以将不 能为植物所利用的碳源转换为可以利 用的 6-磷酸果糖 。当在培养基中只有 6-磷酸甘露糖作为唯一碳源 时，只有含有 MPI 基因 的 转化组织或细胞可以生长 ，而未转化部分因为不能利用而停止生长 ，直至死亡 。MPI 基因在 作者简介：张霞(1978-) ，女 ，汉族 ，硕士 ，主要从事遗传重组微生物及其生物安全性研究。 Tel:0311-3014618, Email: zxx7812@ 1 甜菜 、玉米和小麦 的遗传转化实验上获得了 良好的结果。 1.2. 利用报告基因监测 1.2.1 生化显色标记基因 β-半乳糖苷酶基因（lacZ ）: β-半乳糖苷酶基因是 由 Drahos 等于 1986 年第一个采用的 非抗生素标记基因。带有该基因的微生物在含有底物 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷 的平板上 或溶液 中使菌落变成蓝绿色 。Katupitiga(1995)采用 lacZ 基因标记研究了 固氮螺菌在小麦根 际的定殖动态 。但是在常见 的微生物和植物中均有 β-半乳糖苷酶 的背景活性，使其应用效果 有一定影响 。与 β-半乳糖苷酶基因存在相似问题 的还有碱性磷酸酶基因 （phoA ）和邻苯二酚 2,