khv水苏糖对猪精液冷冻保存效果的影响.pdfVIP

khv水苏糖对猪精液冷冻保存效果的影响 杨升1贾东平1 刘家慧2 1.天津农学院，天津300384;2.青岛滨海学院，青岛266555 摘要：为了提高猪精液冷冻保存效果，试验采用在传统的ZO稀释液基础上分别添加1％、2％、4％、8％的水苏糖的 方法，研究不同浓度水苏糖对猪精液冷冻后精子质量的影响。结果表明，水苏糖相对于对照ZO稀释液能够显著改善 和提高猪精液的冷冻效果，其最佳添加浓度为4％，冷冻-解冻后猪精子活力、活率、质膜完整性以及顶体完整率均 显著提高，水苏糖可以明显抑制精子获能，获能处理前精子获能率仅为32.4％，而获能处理后降为28.6％，有利于抑 制精子获能，精液稀释液中甘油的适宜添加浓度为3％，说明水苏糖与甘油共同作用能在冷冻-解冻过程更加有效地 保护精子。 关键词：猪；精液；水苏糖；冷冻 论文集 半肤胺O．019，BSA0．59 ml／100mI．, 冷冻液I：葡萄糖1．59，乳糖3．09，甘氨酸89，卵黄24 冷冻液II：在I液中加入6％甘油 1．2设备 5810R，德国 高速离心机Eppendorfcentrifuge 水浴锅W20M．2E，美国 超纯水仪Millpom，法国 高压灭菌锅HV-110，日本 超净工作台ESCO，新加坡 精子贮藏冰箱HisenseBC．50，中国北京 移液器EPPENDORF，德国 ECLIPSE 荧光正置显微镜Nikon 50i，日本 伟力彩色精子质量检测系统(CASA)WLJY-9000，中国北京 2试验方法 2．1精液的采集 试验动物为天津某种猪场1．5～2岁体格健壮、性欲旺盛的8头约克夏种公猪。精液采集采用手 握法，采精后选择中段精液，经4层消毒纱布过滤去除胶状物，收集精子富集部分。精液采集后立 即用显微镜进行常规品质检查，精子活率在O．7以上、色泽为乳白色的精液，在35℃～37℃温度于 lh内运抵实验室备用。 2．2精液稀释与冷冻 在室温条件下，过滤后的精液先用常温保存液ZO液按照(v／v)稀释，避光静置lh后以24009 离心3min去上清再添加冷冻稀释l液，于5℃平衡lh再添加等量的稀释II液，使甘油的工作浓度 衡10rain后直接投入液氮保存，冻精解冻时，从液氮中取出细管，迅速投入37C水浴30s，然后稀 释至2mL解冻液中，室温放置10min待检。 2．3冻精质量评定 2．3．1精子活力 移液枪取lO止精液于载玻片上，置于37。C恒温载物台上，在400x显微镜下评定精子活力(直 线前进)，每个片子至少检查200个精子。 2．3．2质膜完整性 2 “北京六马”新时代的猪人工授精产业发展论坛暨第七届全国猪人工授精关键技术研讨会 min 将解冻后的精液用果糖．柠檬酸钠低渗液稀释，调整精子密度为lxl06．2x106／mL，37℃孵育30 后，取20此精子悬液于血细胞计数板上，400×倒置显微镜下观察不同部位5个视野，每次至少数 200个精子，计算弯尾精子的百分率。 2．3．3顶体完整性 rnin，弃上清液；沉淀精子用 将解冻后的精液滴到含3％等温PVP液的离心管内，800xg离心6 37C的PBS溶液重悬，调整精子密度为(1．2)x106／mL。移液枪吸取30止精子悬液，涂片，空气中自 然干燥后，用纯甲醇固定10 min。 之后再用PBS溶液冲洗，空气中自然干燥后加少许增光剂混匀，盖上盖玻片，尽快用400x荧光显微 镜观察。每次检测时，每个片子计数200个精子。 2．3．4精子获能 首先在50此精液中加入500pLHepes缓冲液，以500g离心5min，弃掉上清液，用20pL Hepes缓冲液重悬沉淀。染色