15N标记的气相色谱同位素比质谱与气相气谱质谱联用鉴定微生物反硝化作用.pdfVIP

第39卷 分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告 第8期 2011年8月 ChineseJournalof 1141～1146 AnalyticalChemistry DOI：10．3724／SP．J．1096．2011．Ol141 15N一标记的气相色谱一同位素比质谱与 气相气谱一质谱联用鉴定微生物反硝化作用 艾国民+ 郑海燕 张敏 刘志培 (中国科学院微生物研究所，微生物资源前期开发国家重点实验室，北京100101) 摘 要 中空气的混合气体为分析对象，在样品中N：／0：，CO：，N：0，H：0基线分离的基础上，利用气相色谱一同位素比 质谱对混合气体中N：进行高精密度的∥N分析．同时利用气相色谱一质谱联用的选择离子模式对混合气体 中N：0进行高灵敏度的同位素丰度监测，可对微量N：和戚N：0的生成进行确认，从而基于反硝化作用的主 要代谢产物N：和／或N：0的生成，提出了”N标记的微生物离体反硝化作用鉴定与确认的方法与程序。本方 法程序特别适用于未知微生物反硝化作用的鉴定及反硝化菌株的确认。在合适的”N_标记的底物及培养条 件下，本方法可用于硝化细菌反硝化作用产生的N：的确认。 关键词 气相色谱一同位素比质谱；气相色谱一质谱联用；反硝化作用；氮气；一氧化二氮；产碱杆菌 1 引 言 微生物硝化和反硝化作用是全球氮循环的重要组成部分，其对区域性乃至全球性的水及空气质量 起重要的调节作用“】．。硝化作用是微生物依次将氨转化为亚硝酸盐、硝酸盐的过程；反硝化作用是将硝 酸盐、亚硝酸盐异化还原成N：O和／或N：的过程；硝化细菌的反硝化作用是将氨转化为亚硝酸盐，紧接 着将亚硝酸盐还原成N：0和戚N：的过程(图解1)【2l。目前，已有多种间接或直接测定反硝化速率的方 法，如测定NO；的消失，乙炔抑制法测定N：O的累积，”N标记后色谱法或质谱法测定“N”N，15N”N 等【l】。反硝化作用测定多集中于产物N：的分析，主要是”N标记后质谱法测定含”N的反硝化产物、膜 表示)，需在与空气隔离的情况下，经N：制备与脱水装置、分子筛填充柱分离后进行分析【6】。利用GC— IRMS对空气中氮同位素比测定，一般是对大量的空气样品进行预浓缩，借助冷肼等对样品进行分离后 进行同位素比分析【7．引，或利用预柱去除CO：和H：O，测定N：0；添加铜管去除残留的O。，测定氮气嗍。 目前尚未见对大气或离体反硝化培养的气体混合物在N：，CO：，N：0和H：O基线分离基础上运用GC— IRMS进行氮同位素比测定的报道。 有关微生物反硝化速率测定的报道很多，但如果按照反硝化速率测定的方法对反硝化作用进行确 认或鉴定，由于方法的灵敏度不高或方法定性能力差，可能会造成对某一代谢途径的遗漏，或错误确认。 目前对反硝化作用的确认，主要是对15N标记的硝酸盐(亚硝酸盐)经反硝化作用后的产物N：O和威N： 利用气相色谱一质谱联用(GC—MS)进行确认”¨”，这些方法适合N：0和／或N：浓度较大的样品。目前还 缺乏利用同位素标记以监测反硝化培养后N：0和N：的相对同位素丰度(”N的富集)，对反硝化作用进 行高灵敏度鉴定或确认的方法，特别是缺乏对有空气干扰的样品中氮同位素比进行高精密度与高准确 度分析的方法。 本研究在不去除空气中N：，O：，CO：和H。0的情况下，分析了样品中氧对氮同位素比测定的影响， 建立了微生物反硝化培养所产气体产物中氮同位素比的GC-IRMS分析方法，结合GC—MS选择离子模 式(SIM)对目标化合物的高灵敏度筛查，可确认微量的N：和／或N：O的生成，可用于微生物离体反硝化 201卜O卜12收稿；201卜03—26接受 本文系中科院知识创新课题(No．KJCX2一YW-L08)资助项目 ’E-mail：agm2006@163．corn 万方数据 分析化学 第39卷 作用的快速鉴定及反硝化菌株的确认。 2 实验部分 2．1仪器与试剂