Chk1_2转基因MGC803细胞系的建立与鉴定.pdfVIP

140 Medical Science Journal of Central South China,March2013,Vol.41,No.2 文章编号:2095-1116(2013)02-0140-06 ·方法技术 · Chk1/ 2转基因MGC803细胞系的建立与鉴定 1,2 1 3 3 1 1 1 1 陆丽峰 ,苏摇 波 ,姜摇 浩 ,戴文香 ,向姝霖 ,唐海林 ,凌摇 晖 ,苏摇 琦 (1.南华大学肿瘤研究所 湖南省高校肿瘤细胞与分子病理学重点实验室,湖南衡阳421001; 2. 山东省胶南市经济技术开发区医院病理科;3.南华大学附属第一医院肿瘤内科) 摘摇 要:摇 目的摇 构建Chk1/ 2基因的真核表达载体和建立高表达Chk1/ 2 基因人胃癌MGC803 细胞,为研究 Chk1/ 2功能奠定基础。 摇 方法摇 参照野生型Chk1/ 2基因mRNA全序列,在cDNA 两端各设计一条对应引物,并引 入各自的酶切位点。 从人胃癌MGC803 细胞中提取mRNA作为模板合成Chk1/ 2 cDNA 第一链,并扩增目的基因全 表达序列片断,双酶切后定向克隆至pcDNA3.1(+)真核表达载体,经氨苄青霉素筛选阳性重组质粒,菌液PCR及 测序法对重组质粒进行鉴定。 用脂质体将重组质粒转染入MGC803 细胞,经G418 筛选后,RT鄄PCR及Western blot 检测表达产物。 摇 结果摇 菌液特异性PCR 结果表明克隆的基因片断分别为1.4 kb和 1.6 kb,测序分别证实为 Chk1和Chk2基因,经NCBIBLAST分析与Genbank 中Chk1基因的同源性为100%,编码的氨基酸同源性为100%, Chk2基因的同源性为99%,编码的氨基酸同源性为100%。 G418 筛选转染细胞4 周后获得稳定转染空载体pcD鄄 NA3.1(+)的细胞克隆株和稳定转染重组质粒的 MGC803 细胞。 经 RT鄄PCR 及 Western blot 鉴定,Chk1/ 2 在 MGC803 细胞中的表达比对照组明显增加。 摇 结论摇 成功构建 Chk1/ 2 基因真核表达载体与 Chk1/ 2 高表达 MGC803 细胞,为研究二烯丙基二硫诱导MGC803 细胞G/ M期阻滞的机制奠定了基础。 2 关键词:摇 Chk基因;摇 真核表达;摇 转染;摇 人胃癌MGC803 细胞 中图分类号:R331;R329.2摇 摇 摇 文献标识码:A Construction and Identification of Transfection of Human Chk1/ 2 Gene in Gastric Cancer MGC803 Cells LU Lifeng,SU Bo,JIANG Hao,et al (Key Laboratory of Cancer Cellulal and Moleculay Pathology of Hunan Provincial University, Cancer Research Institute,University of South China,Hengyang,Hunan421001,China) Abstract:摇 Objective摇 To construct the eukaryotic expressionvector andhuman gastric cancer MGC803 cellsof hu鄄 man Chk1/ 2 genefor investigatingthefunction of Chk1