假海源菌ZJCN121基因组文库的构建及岩藻多糖酶基因的筛选.pdfVIP

摘要 岩藻多糖酶能水解岩藻多糖生成低分子量的岩藻多糖，低分子量的岩藻多糖具有 溶解性大、吸收好、抗肿瘤、增强机体免疫等多种生理功能，在医疗和保健方面具有 广阔的开发和应用前景。用岩藻多糖酶制备低分子量岩藻多糖，过程安全，反应条件 温和，对设备要求不高；专一性强，产物较纯净，便于分离提纯精制；对原料要求不 高。但从自然环境中获得天然岩藻多糖酶较难，工艺复杂，因此研究岩藻多糖酶基因， 从基因水平来调控表达岩藻多糖酶就具有深远的意义。 本文以海洋细菌ZJCN121 为材料，按照分子生物学技术构建其基因组文库。采 用 SDS蛋白质电泳初步估计 ZJCN121 菌株产岩藻多糖酶的分子量。采用 CTAB/NaCl 法提取ZJCN121 菌株的基因组DNA，用1.5µLHindⅢ于37℃部分酶切7µL 基因组DNA 2min ，用SanPrep 柱式DNA 胶回收试剂盒回收纯化3-8kb 的酶切DNA 片段，然后与载体pET-32a 连接，转化大肠杆菌BL21(DE3) 。随机挑选转化子进行稳 定性鉴定和插入片段大小分析。结果表明外源插入片段平均大小为6kb 左右，转化子 遗传稳定，获得约2000 个转化子。 在构建的ZJCN121 菌株基因组文库的基础上，用含3%岩藻多糖的Zobell 2216E 培养基筛选含岩藻多糖酶基因的阳性克隆子。用1%刚果红染色和1mmol/LNaCl洗脱， 观察透明圈筛选阳性克隆子，测酶活复筛最终筛选获得一株阳性克隆子。经过酶切和 SDS蛋白质电泳鉴定，发现该阳性克隆子质粒有插入片段，并获得约 60kDa 的蛋白条带，说明该阳性克隆子含有目的基因通过诱导能表达蛋白。对阳性克隆子进 行测序，神经网络启动子预测发现该序列正链启动子预测结果较好，有三处分值最高 为1，开放阅读框预测发现该序列仅有一个开放阅读框长度能包含目的基因片段，分 析该开放阅读框并通过DNAMAN 软件翻译计算，最终获得疑是目的基因序列。 关键字：海洋细菌，基因组文库，岩藻多糖酶 I Abstract Fucoidan can be hydrolyzed into low molecular weight fucoidan(LMWF) by fucoidanase. LMWF were well in solubility, good absorption, anti-tumor, and could enhance immune. They had a variety of functions, resulting broad prospects for development and application in the medical and health care. The process of preparation of LMWF with fucoidanase was safety, mild for reaction conditions, and had