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人Smad3的shRNA表达载体构建和鉴定 作者：谢桥生 雷小英 王立锋 孟艳玲 王芳 薛茜 温伟红 杨安钢 【摘要】 目的： 构建人Smad3的shRNA表达载体，运用RNAi下调Smad3基因在肿瘤细胞系中的表达，观察对肿瘤细胞生长的影响. 方法： 化学合成针对人Smad3基因的dsRNA，瞬时转染入Hela细胞，检测RNA干扰效果，筛选有效干扰靶位点；设计并合成针对人Smad3基因的siRNA寡核苷酸链，经退火形成双链后克隆入质粒载体pSilencerTM3.1H1 hygro，转染入Hela细胞，用hygromycin B筛选稳定单克隆细胞株，对细胞株行RTPCR和Western Blot检测，观察siRNA对靶基因的抑制效果，进一步研究下调目的分子表达水平以后肿瘤细胞生长的变化. 结果： 瞬时转染筛选到了有效的RNA干扰靶位点，构建载体后，建立稳定转染的单克隆细胞株，Smad3 mRNA和蛋白质水平均显著下调，导致肿瘤细胞生长抑制. 结论： 成功构建了针对人Smad3高效、特异、作用持久的shRNA表达载体，转染细胞后可下调Smad3的表达，为进一步研究Smad3的功能和肿瘤的基因治疗奠定了基础. 【关键词】 Smad3；RNA干扰；遗传载体；肿瘤生长抑制 0引言 Smad家族成员是TGFβ信号通路中的重要分子，根据其结构和功能的相似性，可分为三个亚家族，即RSmads（receptor regulated Smads），CoSmads（common Smads），和ISmads（inhibitory Smads）［1］. Smad3是RSmads中的一个成员，参与细胞增殖、分化、细胞外基质调节、肿瘤细胞迁移，与其功能相近的还有Smad2，Smad1，Smad5，Smad8. 近年来，Smads信号通路在肿瘤细胞中的作用逐渐引起人们的关注，有望成为肿瘤治疗中的潜在有效靶点［2-5］. 我们通过瞬时转染dsRNA（doublestranded RNA，双链RNA）入Hela细胞，筛选有效的siRNA（small interference RNA）序列，并构建shRNA（small hairpin RNA）表达载体，建立持续低表达Smad3的稳定细胞株，以期进一步探求Smad3下调后对肿瘤生物学性状的影响. 1材料和方法 1.1材料质粒载体pSilencerTM3.1H1 hygro由西京医院刘家云博士惠赠；大肠杆菌DH5α、宫颈癌细胞系Hela由本实验室保存；细胞培养试剂、TRIZOL Reagent RTPCR试剂盒、hygromycin B，LipofectamineTM 2000（ Invitrogen公司）；牛血清白蛋白（BSA）、兔抗人antiSmad3多克隆抗体（sc8332，Santa Cruz公司）；兔抗人antiActin多克隆抗体、HRP标记羊抗兔二抗（武汉博士德公司）；NC膜（Millipore公司）；BCA法蛋白定量试剂盒、Western Blot发光液（Pierce公司）；各种限制性核酸内切酶、T4 DNA连接酶（TaKaRa公司）；小量质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、质粒中提试剂盒（Promega公司）. Western Blot设备（BIORAD公司）；凝胶成像仪（ULTRAVIOLET公司）；高速离心机（Beckman公司）；紫外分光光度计（Ultrospec 2000，Pharmacia Biotech公司）；PCR仪（PTC 200，MJ Research公司）；酶联免疫检测仪（Model 500，BIORAD公司）. 1.2方法 1.2.1siRNA的设计根据RNA干扰靶位点的设计原则，从Smad3 mRNA（NM_005902）的编码序列中寻找符合设计特征的靶位点，经BLAST软件进行同源分析证实为Smad3特异性序列后，选择其编码区第941～959位核苷酸为干扰靶位点，由上海吉玛公司合成其dsRNA序列，Smad3正义链：5′GCACAUAAUAACUUGGACCdTdT 3′，反义链：5′CGUGUAUUAUUGAACCUGGdTdT3′. 由公司提供的阴性对照dsRNA与人类基因无同源性，正义链：5′UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT3′，反义链：5′AAGAGGCUUGCACAGUGCAdTdT3′. 1.2.2shRNA表达质粒载体的构建按上述靶位点构建shRNA表达载体，根据pSilencerTM3.1H1 hygro质粒载体的要求设计1对能编码sh