人端粒酶逆转录酶基因RNAi表达载体的构建、鉴定.docVIP

人端粒酶逆转录酶基因RNAi表达载体的构建、鉴定 作者：毛立军，郑骏年，李望，郑宏祥，刘俊杰，孙晓青，陈家存，温儒民 【关键词】 重组质粒 　　摘要 :目的 构建端粒酶逆转录酶（hTERT）基因的RNA干扰（RNAi）表达载体。 方法 化学合成能编码针对hTERT基因的短发夹RNA（shRNA）序列的寡核苷酸，退火处理后克隆到pSilencer1.0-U6shRNA表达载体的U6RNA聚合酶Ⅲ（PolⅢ）启动子的下游，构建重组RNAi质粒pSliencer-hTERT。 结果 经酶切电泳及测序分析证实，目的序列成功插入到预计位点。 结论 已成功构建pSliencer-hTERT载体，为进一步研究其对端粒酶活性的抑制作用打下基础。 　　关键词 :RNA干扰;短发夹RNA;人端粒酶转录酶;重组质粒; 　　Abstract:Objective To construct the expressing vector of small hairpin RNA（shRNA）targeting human telomerase re-verse transcriptase（hTERT）gene.Methods Two template DNA oligonucleotides for shRNA expression targeted hTERT gene were chemically synthesized.The annealed shRNA templates were processed to produce and identify the recombinant RNAi plas-mid sPilencer-hTERT.Results It was demonstrated that shRNA template targeting hTERT gene had been inserted at the ex-pected site and the insertion sequence was perfectly correct.Conclusion RNAi expression vector targeting hTERT gene has been constructed successfully and will be used as a useful method to develop specific hTERT-silencing therapeutics. 　　Key words:RNA interference;small hairpin RNAs;human telomerase reverse transcriptase;recombinant plasmid 　　端粒酶的活化与恶性肿瘤的发生、发展密切相关，通过激活端粒酶，端粒DNA得以延长使细胞永生。端粒酶逆转录酶（hTERT）是催化这一反应的惟一限速酶，因此有希望成为肿瘤治疗的理想靶点。RNA干扰是近年迅速发展起来的一项新的基因阻断技术，能特异、高效地阻抑靶基因表达，有望成为肿瘤基因治疗的有力工具［1］。本实验将针对hTERT mRNA的小干扰RNA（siRNA）模板插入siRNA表达载体，构建载体hTERT-siRNA表达载体，为进一步研究其对端粒酶活性的抑制作用打下基础。 　　1 材料和方法 　　1.1 主要试剂 pSilencer1.0-U6质粒为美国Am-bion公司产品，大肠杆菌JM109由徐州医学院生物化学教研室保存。T4DNA连接酶以及小量质粒提取试剂盒购自Promega公司，限制性内切酶BamHⅠ 和HindⅢ购自MBI公司。 　　1.2 实验方法 　　1.2.1 模板DNA合成 选择2段hTERT mRNA的序列作为RNA干扰的靶序列，序列一针对的是hTERT基因显性失活突变体区（NM003219:碱基序列位置2182-2200）。序列二采用Ambin公司的网上设计软件（）进行设计，所对应的的靶序列为hTERT（NM003219:747-765）。设计2对编码短发夹RNA序列的DNA单链。序列一:P1:5′-CAAGGTGGATGTGACGGGCTTCAAGAGAGCCC-GTCACATCCACCTTGTTTTTT-3′，P2:5′-AATTAA-AAAAGCCCGTCACATCCACCTTGTCTCTTGAACAAG-GTGGATGTGACGGGCGGCC-3′。序列二:P1:5′-GTCTGCCGTTGCCCAAGAGTTCAAGAGACTCTTGGG-CA