大菱鲆4种生物标志物基因的克隆、组织特异性表达的研究及重组蛋白制备.pdf

谨以此论文献给对我严格要求的导师，给予我无 私关怀的父母和一直支持帮助我的实验室同学们。 —穆小生 大菱鲆4 种生物标志物基因的克隆、组织特异性表达研究及重组蛋白制备 大菱鲆4 种生物标志物基因的克隆、组织特异性 表达研究及重组蛋白制备 摘要 大菱鲆（Scophthalmus maximus ）原产于北大西洋欧洲沿岸，雷霁霖院士于 1992 年将大菱鲆引入中国，经过20 年的艰苦努力，大菱鲆已经成为我国北方沿 海主要海水养殖品种。目前，大菱鲆工厂化养殖产业年产量已达6 万多吨，年总 产值逾40 亿元。本研究在课题组前期建立的大菱鲆多种组织的高温、饥饿、盐 度胁迫基因表达谱文库中，筛选出涉及大菱鲆摄食、生长、应激等重要养殖生理 调控相关的功能基因，可作为定量评价大菱鲆养殖生理指标的生物标志物，本论 文通过对其 cDNA 全长序列克隆、表达模式研究、功能分析等开展工作，为建 立大菱鲆生理指标的分子检测手段打下基础，并为大菱鲆标准化养殖模式的构建 提供依据。 本论文的主要内容： 1、4 种大菱鲆生物标志物：食欲素（Orexin）、生长催乳素（Somatolactin ）、钙 网蛋白（Calreticulin ）和谷氨酸脱氢酶（Glutamate dehydrogenase ）基因的克隆 和序列分析 本研究采用RT-PCR 和cDNA 末端快速扩增技术(rapid-amplification of cDNA ends,RACE) 的方法, 从大菱鲆中克隆得到了食欲素（Orexin ）、生长催乳素 （Somatolactin）、钙网蛋白（Calreticulin ）基因的cDNA 全长序列和谷氨酸脱氢 酶（GDH）的ORF 序列。结果如下：Orexin 的cDNA 序列全长737bp，其中ORF 长453bp ，共编码150 个氨基酸，其中包括47 个氨基酸的信号肽、43 个氨基酸 的Orexin-A、28 个氨基酸的Orexin-B 和末尾 16 个氨基酸组成的功能不详的多 肽，5’UTR 长度为15bp，3’UTR 长度为269bp 。Somatolactin 的cDNA 序列全长 1780bp，其中ORF 长702bp，共编码233 个氨基酸，5’UTR 长度为28bp ，3’UTR 长度为 1050bp。Calreticulin 的cDNA 序列全长2158bp ，其中ORF 长 1263bp， 共编码 420 个氨基酸，5’UTR 长度为 59bp，3’UTR 长度为 836bp。Glutamate dehydrogenase 的ORF 长1629bp，共编码542 个氨基酸。 I 大菱鲆4 种生物标志物基因的克隆、组织特异性表达研究及重组蛋白制备 2 、4 种大菱鲆生物标志物：食欲素（Orexin ）、生长催乳素（Somatolactin）、 钙网蛋白（Calreticulin）和谷氨酸脱氢酶（GDH）基因的组织特异性表达 采用Real time PCR 技术对Orexin、Somatolactin、Calreticulin 和GDH 基因 在大菱鲆14 种组织中的表达模式进行了研究。结果显示，Orexin 除了在肠中未 检测到表达之外，在其他 12 个组织中均检测到该基因的表达，其中在下丘脑中 表达量最高，在肾和脾中检测出微量表达；Somatolactin 在肌肉中未检测出表达， 在胆和肝脏中检测出微量表达，在其他的 11 种组织中垂体的表达量最高； Calreticulin 在肠、肝脏、头肾和垂体这4 个组织中的表达量均很高，但在肌肉、 肾、前脑和中脑中则几乎不表达；GDH 在肾脏中未检测出表达，但在其余13 种 组织中表达量均较高，且中头肾表达量为最高。 3、大菱鲆食欲素（Orexin）、生长催乳素（Somatolactin）和钙网蛋白（Calreticulin ） 基因工程载体构建和重组蛋白制备 分别将Orexin、Somatolactin 和Calreticulin 的cDNA 编码框序列与pET-24a 表达载体相连并转化到大肠杆菌BL21 宿主菌，构建了异源重组蛋白