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利用紫外-可见光吸光度法或 技 术 荧光法进行蛋白微量定量 说 明 David L. Ash 和Andrew F. Page | Thermo Scientific NanoDrop 产品，美国特拉华州威明顿市 简介 图1：左上角：在测量底座上加载2 μL 蛋白样品，左下 尽管分光光度法或荧光法是蛋白定量的常用方法，但是在选择检测技术时必 角：样品测量时底座间形成的液柱，右侧：软件输出，显 须考虑若干因素。直接紫外A280 吸光度法、比色法和荧光法在很多情况下 示光谱图和数据 不能互换，且必须考虑蛋白浓度、所用缓冲液、时间限制和样品要求。使用 NanoDrop™ 的微量功能可使三种定量方法都获益。 微量测量 NanoDrop 紫外-可见光分光光度计采用革命性的样品保 留技术，通过表面张力的作用，可以将1 – 2 μL 样品保 留在两根光纤之间。测量后，使用普通实验室无尘纸即可 线性范围 简便快捷地从光学表面除去样品。用户友好型软件上将显 分光光度法的典型吸光度上限约为1.5 A，进而定义了蛋 示最终蛋白浓度、纯度比和样品光谱图 （图1）。 白的最高可测量浓度。使用固定光程测量蛋白样品，一般 NanoDrop 2000/2000c 分光光度计采用可实时改变的多光 采用1 cm 石英比色皿，这限制了传统分光光度法的线性 程 （1.0、0.2、0.1 和0.05 mm）来测量2 μL 蛋白样品 范围，因而需要稀释样品。此类稀释既浪费时间又耗费样 （图1），这样的宽动态范围，能够使用直接紫外A280 软 品，还可能发生移液误差。采用NanoDrop 分光光度计 件模块测量0.1 – 400 mg/mL 的纯化BSA 蛋白。该自动化 的微量样品保留技术和直接紫外A280 测量法测量纯化蛋 光程优化过程无需样品稀释，提高了精度。与此相反，传 白样品时，用户使用2 μL 样品即可直接快速测量浓度高 统分光光度计采用标准的10 mm 石英比色皿测量样品，一 达400 mg/mL （BSA 蛋白）的样品 （图2 ）。NanoDrop 般检测上限约为1.8 mg/mL，并需要500 倍体积的样品才 样品保留技术的检测上限比标准1 cm 光程石英比色皿高 能满足最小样品体积要求(1 mL)。此外，使用比色皿时如 200 倍。 清洗不当，可能导致与前次样品交叉污染。 执行同一检测时，微量比色法与传统的基于比色皿的比 NanoDrop 2000c 的测量时间不足5 秒，在需要更高通 色法的性能相当，因为尽管吸光度信号被降低了大约 量的情况下，NanoDrop 8000 最多可同时测量8 个样 10 倍，但是检测限制通常在于检测方法本身而非所用的