利用Crelox定位重组系统获得无选择标记GFP转基因烟草.pdfVIP

中国农业科学 2008,41(10):2973-2982 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2008.10.009 利用Cre/lox定位重组系统获得无选择标记 GFP 转基因烟草 宋洪元，任雪松，司 军，李成琼，宋 明 （西南大学园艺园林学院/重庆市蔬菜学重点实验室，重庆 400715 ） 摘要：【目的】利用 Cre/lox 系统具有的特异重组特性，以绿色荧光蛋白GFP 为目的基因，获得无选择标记 的 GFP 转基因烟草。【方法】将Bar 基因表达盒置于两个同向lox位点之间并与 GFP 基因表达盒融合后获得相应植 物表达载体，转化烟草后获得抗除草剂 Basta 的 GFP 转基因植株。GFP 转基因植株叶盘二次转化导入重组酶 Cre 基因后，实现与 GFP 基因连锁的 Bar 基因表达盒剔除，剔除 Bar 基因的植株开花后自交使重组酶 Cre 基因分离， 获得无选择标记的 GFP 转基因烟草。【结果】将含Bar 基因表达盒以及 GFP 基因表达盒的植物表达载体转化烟草 Wisconsin 38 后获得了抗除草剂Basta以及 GFP 荧光表达的转基因植株。随机抽取5株转基因植株二次转化导入 -1 Cre 基因，所获得的再生植株叶盘进行 Basta 的抗性检测，绝大多数单株对应叶盘在含 8 mg·L PPT （phosphinothricin）的筛选培养基上无法再生死亡，删除效率在 76%～100%。对Bar 基因删除后区域片段进行 克隆测序分析显示，Bar 基因表达盒已经被精确删除。Bar 基因删除植株开花后自交，获得的自交后代进行NPTⅡ 抗性检测，NPTⅡ敏感植株分子检测显示均只含有 GFP 基因。【结论】利用 Cre/lox 系统获得烟草无选择标记的转 基因植物是稳定可行的,可广泛应用于其它无选择标记转基因植物的培育。 关键词：Cre/lox定位重组系统；无选择标记转基因烟草；绿色荧光蛋白；转基因 Construction of Marker-free GFP Transgenic Tobacco by Cre/lox Site-specific Recombination System SONG Hong-yuan, REN Xue-song, SI Jun, LI Cheng-qiong, SONG Ming ( Vegetable Science Key Laboratory of Chongqing/Horticulture and Landscape Colleage of Southwest University, Chongqing 400715) Abstract: 【Objective 】Marker-free GFP transgenic tobacco plants were constructed based on Cre/lox site-specific recombination system. 【Method 】A GFP gene was intoduced into the tobacco genome by using the Bar gene as a linked selectable marker flanked by recombination sites in a directed orientation.The Bar gene expression box was subsequently excised from the plant genome by a strategy of Cre