Pyrosequencing技术在遗传疾病诊断中的常见问题和解决方法.pdfVIP

Gene News 基因快讯 年第 期 2008  Pyrosequencing 技术在遗传疾病诊断中的常见问题及解决方法 目前，Pyrosequencing技术被越来越多的应用于 区域的小核蛋白多肽N基因（SNRPN）在父本和母本 临床快速分子诊断，如通过Pyrosequencing技术检测 遗传的甲基化程度的差异分析，可以用来辅助诊断普- MTHFR编码基因的C677T位点的基因型，作为成年人 威综合征和安格尔曼综合征。 冠心病和中风的辅助诊断手段；通过检测ApoE基因上 实验步骤： 的SNP112和SNP158，作为阿滋海默征的辅助诊断手 一、重亚硫酸盐处理病人DNA样本 段；对人基因组上15q11-13区域的甲基化状态进行检 测，这作为临床上普－威综合症和安格尔曼综合症的诊 获得临床病人的DNA样本后，使用EZ DNA 断手段；对MLH1基因－248至227中四个甲基化位点的 Methylation Kit (Zymo Research)试剂盒来处理样 定量检测，计算这些位点的甲基化称度，这可作为临床 本，每个样本的用量为2μg，按试剂盒的标准protocol 上结肠癌、子宫内膜癌、胃癌的辅助诊断方法；定量测 进行操作，最终使用10μl洗脱缓冲液洗脱DNA。通过 定P16基因－24至－11中的四个甲基化位点的甲基化程 重亚硫酸盐试剂处理后，DNA序列上甲基化的C由于 度，这作为非小细胞型肺癌、结肠癌、淋巴癌和膀胱 甲基的保护，不发生脱氨基反应，非甲基化的C发生脱 癌的辅助诊断手段。使用Pyrosequencing技术对微生物 氨基反应变成U，而PCR后U位点转换为T，所以最终 16S和23S rDNA特定序列分析可以鉴定结合杆菌，幽 甲基化的CG位点变成潜在的C/TG多态位点。对于非 门螺旋杆菌等多种临床相关的微生物，可以通过检测 CpG位点上的C，它们一般情况下是不会被甲基化的， rpoB等基因特定序列来判定微生物的耐药性。 所以重亚硫酸盐处理PCR后，这些位点应该全部转变成 本文以Pyorsequencing用于临床上普－威综合症和 T，这些位点可以作为重亚硫酸盐处理是否完全的内在 安格尔曼综合症的诊断为例，详细说明实验的操作，并 质控。 对实验中遇到的常见问题和解决方法进行讨论。 二、设计Pyrosequencing反应的引物， 普-威综合征（Prader-Willi syndrome, PWS） PCR 和安格尔曼综合征（Angelman syndrome, AS）是两 使用Biotage AB公司的Assay Design Software 种临床症状和遗传形式不同的遗传疾病，但是，两者的 设计针对SRNPN位点的PCR引物和测序引物，设计的 致病因素都与15号染色体长臂11-13区（15q11-13）印 PCR引物如下： 记基因聚集区有关。使用Pyrosequencing对15q11-13 引物名称 位置 序列 A1031F 173957 - 173979 AGGGAGTTGGGATTTTTGTATT A1032RB 174170 - 174195 Biotin - CCCCAAACTATCTCTTAAAAAAAAC A1035FB* 173957 - 173979 Biotin - AGGGAGTTGGGATTTTTGTATT