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例如 RFLP （限制性片段长度多态性）法 ： 　①. 原理：限制性内切酶能识别并切割特异核苷酸序列。 　某位点核苷酸序列发生突变→有可能导致缺失或产生新的限制性酶切位点。 若突变只发生在同源染色体的一条 上，另一条正常，限制性内切酶酶切→ DNA片段带型可用于鉴别同源染色体的差异。 酶切后产生的DNA片段长度的差异， 称为限制性片段长度多态性　(restriction　fragment　length polymorphisms，RFLP)。RFLP差异具有共显性特点。 ②. 镰刀性贫血病的诊断： 　该病由β－球蛋白基因一个核苷酸突变（由GAG变成GTG)导致的，这个核苷酸改变也正好导致一个限制性酶切位点改变。 杂合体经酶切产生带型差异，识别该位点。 三、转基因动物: 与转基因植物相比，转基因动物的发展要慢些。 转基因动物：目的基因+载体?重组DNA?微量注射法 将重组DNA导入受体合子细胞核中?遗传转化。 如：利用转基因羊，大量表达人类的抗胰蛋白酶。 　　可分泌人类生长因子Ⅸ的转基因羊“Polly”(下图)。 (Wilmut等，Nature 385, 1997) 克隆动物、转基因动物区别 转基因牛：受精卵注射法 人类生长激素转基因猪 同胞鼠对照 转移有人类生长激素转基因鼠 四、 遗传疾病诊断 利用重组DNA技术进行遗传疾病诊断，是直接从DNA即基因水平进行诊断?准确度高，速度快。 BamH I酶切位点 * * 在分子水平上，采取工程建设方式 ，按照预先设计的蓝图 ，借助于实验室技术将某种生物的基因（基因组）或人工合成的基因，转移到另一种生物细胞中， 使后者定向获得新的遗传性状的一门技术。 基因工程技术的建立，使所有实验生物学领域产生巨大的变革——定向改变生物遗传学特性，甚至产生新的生物。 基础：分子遗传学理论 工具：分子生物学、核酸生物化学以及微生物遗传学的现代方法和手段 第二节 基因工程 一、基因工程发展 1971年　史密斯（Smith H. O.）等人从细菌中分离出的一种 　　　　限制性酶→酶切病毒DNA分子，标志着DNA重组 　　　　时代的开始。 1972年　伯格（Berg P.）等用限制性酶分别酶切猿猴病毒和 　　　　λ噬菌体DNA，将两种DNA分子用连接酶连接起来 　　　　得到新的重组DNA分子。 1973年　科恩（Cohen S.）等进一步将酶切DNA分子 与质粒DNA连接起来，并将重组质粒转入E. cloi细胞。 目的基因与载体结合并转入受体细胞， 基因工程成为可能 1982年，美国食品卫生和医药管理局批准，用基因工程在细菌中生产人的胰岛素投放市场。 1985年，转基因植物获得成功（利用基因过程技术将目的基因转入植物体内并在其中表达，这种植物）。 1986年，穆勒斯发明了PCR技术， 专利转让达3亿美元。 1990 年9月14日是基因治疗的诞生日。 在美国马里兰州的一个医疗中心进行第一例基因治疗临床试验。一个4岁的小女孩戴斯瓦(A.eSilva)，患有严重综合免疫缺失症（SCID）。将腺苷酸脱氨酶（ADA）基因转入骨髓细胞，再送回病人体内，基因治疗SCID 获得初步效果。 1994年，延熟保鲜的转基因番茄商品生产。 二、基因工程研究内容 　1．从细胞和组织中分离DNA，或人工合成基因； 　2．限制性内切酶酶切DNA分子，制备DNA片段； 　3．将酶切DNA分子与载体DNA连接 →构建能在宿主细胞内自我复 制的重组DNA分子； 　4．把重组DNA分子引入宿主受体细胞→ 复制； 　5．重组DNA随宿主细胞的分裂而分配到子细胞→ 建立无性繁殖系(clone) 或发育成个体； 　6．从细胞群体中选出所需要的无性繁殖系→ 并使外源基因在受体细胞中 正常表达，翻译成蛋白质等基因产物、回收；或筛选出获得定向性状 变异的个体。 即三步（1）目的基因获得（2）目的基因与载体重组（3）转入受体细胞并表达 三、基因工程步骤 （一）目的基因获得 1、目的基因的分离 从细胞和组织中分离DNA。 （1）利用噬菌体或质粒摄取基因——单拷贝基因 噬菌体λ和φ80分别感染大肠杆菌，分别在LacZ两侧插入整合→UV照射，不准确脱离，λ和φ80可能带有LacZ基因，即λLac和φ80Lac，但Lac区段方向相反有互补关系→变性处理，离心取出λLac和φ80Lac各自H链混合→在Lac区段两H链互补成双链，两侧不能互补的成单链LacZ用核酸外切酶切去得Lac。 （2）鸟枪射击法——多拷贝基因 用限制性内切酶或超声波处理→各种大小DNA片段→凝胶电泳分开各DNA片段→分层切