苏云金杆菌高效杀虫工程菌的构建及其伴胞晶体形成机制的研究.pdf

分类号 密级 学校代码 10542 学号200710410003 苏云金杆菌高效杀虫工程菌的构建及其伴 胞晶体形成机制研究 Constructionof Bacillus thuringiensis engineering strainwith and on highefficiency the study mechanismof formation parasporal crystal 研 究 生 姓名 李文萍 指导教师姓名、职称 夏立秋教身受 学 科 专 业 微生物学 研 究 方 向 微生物分子生物学 湖南师范大学学位评定委员会办公室 二0一二年六月 IIIII I II I IIIIIIIL I I III Y2147258 摘 要 苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)作为一种环境友好型生 物杀虫剂，对靶标害虫具有专一的杀虫活性，因此被广泛使用于农林业虫害以及 蚊媒传播疾病的控制。它的杀虫特性主要来源于在芽胞形成期大量产生的杀虫活 性蛋白。尽管在生态环境保护方面具有无可比拟的优势，但Bf生物杀虫剂的使 用仍然落后于合成的化学农药。对Bf菌株进行遗传改良，可为发展新型B≠生物 杀虫剂产品提供更好的技术与菌种资源。 为获得毒力更高、杀虫谱更广的曰f菌株，进一步扩展Bf杀虫剂在生物防治上 的应用，本研究采用分子手段，利用Bf偏爱密码子优化设计了昆虫特异的钙离子 3’． 通道阻断剂基因co-ACTX-Hvla，并进行化学合成，与杀虫晶体蛋白基因crylAc 端融合，在历中进行共表达，并研究了融合蛋白的晶体形成情况和生物活性功能。 光蛋白基因egfp在历无晶体突变株Cry．B中得到了有效的融合表达。通过显微镜 个较小的类似伴胞晶体的包涵体，在菌体裂解后仍然是稳定的。在对Bf工程菌表 达产物进行的免疫杂交分析中，全长166kDa的融合蛋白带被清晰的检测到，说明 融合基因可以在B，中进行完整的表达。通过对工程菌发酵产物进行生物活性测定， 发现融合蛋白晶体对甜菜夜蛾幼虫的毒力比CrylAc晶体提高了至少5倍，对棉铃 虫幼虫也具有很高的毒力且明显抑制了幼虫的生长。这些结果说明，外源杀虫蛋 白可以采取与Cry类内毒素C一端融合的方式在Bf中共表达，共同形成伴胞晶体， 并至少保留部分杀虫生物活性。本研究为构建具有不同杀虫特性的融合蛋白以及 构建高效广谱的Br工程菌株奠定了重要基础。 目前，研究者们虽然对cry基因的表达调控已经进行了广泛研究，但由于在 细菌活体中观察Cry蛋白的聚集过程比较困难，缺乏好的检测手段，因此人们 对此类蛋白晶体形成的机制仍然很不清楚。本研究以Bf融合基因工程菌Cry．B (1Ac．ACTX．EGFP)为研究对象，利