国境口岸O1群和O139群霍乱弧菌和霍乱肠毒素三重实时PCR的检测方法 编制说明.docVIP

出入境检验检疫行业标准草案编制说明 编写模版（格式） 出入境检验检疫行业标准草案编制说明的编写模版 1 基本信息 1.1 标准草案名称 中文 国境口岸O1群和O139群霍乱弧菌和霍乱肠毒素三重实时PCR的检测方法Detection method for O1 serotype、O139 serotype Vibrio cholera and enterotoxin by triplex real-time fluorescence PCR at frontier ports 霍乱弧菌（Vibrio cholera）根据菌细胞表面脂多糖抗原的不同，被分成 200多个不同的血清群，其中仅O1群和O139群能引起暴发流行。O1群霍乱弧菌可分为古典生物型(Classical biotype)和埃尔托生物型（El Tor biotype）。由O1群和O139群霍乱弧菌引起的急性肠道传染病称为霍乱，它具有发病急、传播快、波及面广的特点，临床表现轻重不一，轻者仅有轻度腹泻，重者表现为剧烈的呕吐、腹泻，如不及时救助，会引起严重脱水导致死亡。霍乱是我国《传染病防治法》规定的两种甲类传染病之一，也是《国际卫生检疫条例》规定国际检疫的三种传染病之一。霍乱是一种古老且流行广泛的烈性传染病，曾在世界上引起七次大流行。1817年至1923年的百余年间，在亚、非、欧、美等发生的六次世界性霍乱大流行是由古典生物型引起的，给人类带来了巨大的灾难。1961年开始的第七次世界性霍乱大流行，是由埃尔托生物型引起的，至今已波及五大洲140个以上的国家和地区，报告病例数在400万以上，目前尚无停息的迹象。1992年10月印度和孟加拉国相继发生由O139群霍乱弧菌引起的新型霍乱暴发，该型霍乱随后在亚洲传播，至今已有印度、孟加拉国、中国、巴基斯坦、泰国、马来西亚、新加坡等报告发生O139群霍乱病例。根据WHO的年度报告（2000-2002），全球总计至少有11399人死于霍乱（96%集中在非洲）。我国目前的霍乱疫情呈现多菌群（型）混合流行的局面，专家预测今后霍乱发病可能会进一步上升，疫情形势仍十分严峻。霍乱弧菌传播主要通过粪、口及水体途径传播。境外的患者或者被患者粪便污染的物品、水体可能通过国境口岸、船舶等将细菌带入，引起霍乱弧菌在我国的传播和流行。随着与世界各国交流的日益频繁，在国境口岸建立一种针对O1群和O139群霍乱弧菌的快速检测方法，是检验检疫机关迫切而重要的工作内容之一。目前检测O1群和O139群霍乱弧菌的方法主要有传统的细菌生化鉴定、免疫学以及分子生物学方法。然而传统细菌生化鉴定方法工作量非常大，而且检测时限长（至少需要2-7天时间），灵敏度偏低；如果样品中目标菌含量低或处于“VBNC”状态（aviable but nonculturable state，活的非可培养状态），就无法检出；如果菌株表型谱异常，则会发生错检和漏检。免疫学方法也存在特异性低、灵敏度差的特点。普通的分子生物学方法需要凝胶电泳，操作复杂且易引起交叉污染等问题，目前所公布的荧光PCR方法也是采用单重的方式进行检测，不利于口岸的快速检测。多重荧光PCR使用多对引物及多条探针，能同时对多个靶位点进行同时扩增，能节约试剂和节省人力、时间，具有简便快速、特异性高、易于自动化、实时监测结果及信息量大等诸多优点。同时荧光PCR的检测灵敏度能到达到1拷贝，线性范围广、可检测的样品浓度线性范围10^1～10^10，重复性CV值≤2.1%。国内涉及霍乱弧菌检测的标准有多项，但采用分子生物学方法的标准有4项，分别为以下标准： 出入境口岸霍乱弧菌多重聚合酶链反应操作规程（ SN/T 1872-2007），标准采用多重PCR方法检测霍乱弧菌菌株的霍乱肠毒素基因，最终需要采用凝胶电泳进行结果判断，不适于口岸目前的卫生检疫快速、高效的工作要求，同时也存在污染的风险； 国境口岸霍乱弧菌的荧光PCR检测方法（SN/T 2332-2009），标准采用单一荧光PCR方法检测01群霍乱弧菌菌株和O139群霍乱弧菌菌株，该标准进行霍乱弧菌检测需要制备两组反应液分别检测01群霍乱弧菌和O139群霍乱弧菌，检测效率有所降低，不利于快速通关； 进出口食品中霍乱弧菌快速及鉴定监测方法 实时荧光PCR方法（SN/T 2425-2010），标准采用单一荧光PCR方法检测霍乱弧菌菌株，该标准进行霍乱弧菌检测需要制备三组反应液分别检测01群霍乱弧菌、O139群霍乱弧菌及非O1群、O139群霍乱弧菌，效率有所降低，并且该标准适合于食品中霍乱弧菌的检测，不适合卫生检疫工作中各类样本的检测； 食品中霍乱弧菌分群检测 MPCR-DHPLC法（SN/T 2562-2010），标准采用多重PCR方法联合变性高效液相色谱技术进行霍乱弧菌菌株的分群检测，