国境口岸O1群和O139群霍乱弧菌和霍乱肠毒素三重实时PCR的检测方法.docVIP

ICS点击此处添加ICS号 点击此处添加中国标准文献分类号 SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T XXXX—XXXX 国境口岸O1群和O139群霍乱弧菌和霍乱肠毒素三重实时PCR的检测方法 Detection method for O1 serotype、O139 serotype Vibrio cholera and enterotoxin by triplex real-time fluorescence PCR at frontier ports 点击此处添加与国际标准一致性程度的标识 XXXX - XX - XX发布 XXXX - XX - XX实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布 前言 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国宁波出入境检验检疫局、中华人民共和国珠海出入境检验检疫局 本标准主要起草人：周冬根、翟敏、李红、孙大为、郑剑宁、裘炯良、张升、张锜、杨天赐、杨泽、莫秋华。 本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。 国境口岸O1群和O139群霍乱弧菌和霍乱肠毒素三重实时PCR的检测方法 范围 本标准规定了国境口岸O1群和O139群霍乱弧菌以及霍乱肠毒素基因三重实时PCR检测方法检验的对象、标本采集、检测程序、结果报告及阳性结果的处置。 本标准适用于国境口岸对O1群和O139群霍乱弧菌以及霍乱肠毒素基因的实验室检验。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 19489 实验室生物安全通用要求 WS/T230 临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用 SN/T 1239—2003 国境口岸霍乱检验规程 WS 233 微生物和生物医学实验室生物安全通用准则 术语与定义 下列术语和定义适用于本标准。 O1群霍乱弧菌 O1 serotype vibrio cholera 菌体抗原由3种抗原因子A、B、C组成，又可分为3个血清型：小川型、稻叶型和彦岛型。根据表型差异，O1群霍乱弧菌的每一个血清型还可分为2个生物型，即古典生物型和El Tor生物型。 O139群霍乱弧菌 O139 serotype vibrio cholera 其临床表现及传播方式上与O1群霍乱弧菌完全相同，但不能被O1群霍乱弧菌诊断血清所凝集，抗O1群的抗血清对O139菌株无保护性免疫。在水中的存活时间较O1群霍乱弧菌长。 霍乱肠毒素vibrio cholera enterotoxin 是目前已知的致泻毒素中最为强烈的毒素，是肠毒素的典型代表。作用于肠细胞膜表面上的受体, 导致肠粘膜细胞分泌功能大为亢进，使大量体液和电解质进入肠腔而发生剧烈吐泻。 检测对象 霍乱感染病例、霍乱感染嫌疑人的排泄物、呕吐物。 被霍乱弧菌污染或有霍乱弧菌污染嫌疑的交通工具、行李、货物、集装箱、邮包、饮用水、压舱水、污水、餐饮用具、生活用品。 其他国境口岸环境样本，蝇及蜚蠊样本。 主要仪器设备 ——超净工作台； ——二级生物安全柜； ——微型混合器、涡旋振荡器； ——冰箱:4℃；–20℃； ——恒温金属浴； ——普通台式离心机； ——高速冷冻离心机（离心力可达20 000 g）； ——可调式微量加样器（10 μL、100 μL、1000 μL）及配套带滤芯吸头； ——荧光PCR检测仪（如ABI Prism vii7、ABI Prism 7500、ABI Prism 7000型等）。 主要试剂 本方法使用的主要试剂如下： ——Qiagen multiplex PCR kit检测试剂盒)； ——无RNA酶的DEPC水； ——引物和探针：针对O1群霍乱弧菌、O139群霍乱弧菌及霍乱肠毒素核苷酸高度保守区进行设计，引物和探针序列见表1。 表1 荧光PCR检测的引物和探针 引物/ 探针名称 序列（5’-3’） 扩增片段 大小(bp) O1-F CCAGATTGTAAAGCAGGATGGA 163 O1-R GGTCATCTGTAAGTACAAC O1-P FAM-CCCGGAGTTTGTAAGCCCACTACCGGG-DABCYL O139-F CATACCAACGCCCTTATCCATT 120 O139-R GCATGACTGGCATCCCAAAAT O139-P HEX-CGGGTGAGAAAAGACAGCAATAACACCCG-DABCYL ctxA-F TCCGGAGCATAGAGCTTGGA 80 ctxA-R TCGATGATCTTGGAGCATTCC ctxA-P