实验六琥珀酸脱氢酶作用及其竞争性抑制.docVIP

实验五　琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制 【实验目的】 1、掌握竞争性抑制概念及作用机理。 2、了解在无氧情况下观察脱氢酶作用的简单方法。 【实验原理】 存在于心肌、骨骼肌、肝脏等组织中琥珀酸脱氨酸，能使琥珀酸脱氢而成延胡索酸，脱下氢可使甲烯蓝退色，还原为甲稀白。反应如下： 草酸、丙二酸等在结构上与琥珀酸相似，可与琥珀酸竞争与琥珀酸脱氢酸的活性中心结合。若酶已与丙二酸等结合，则不能再与琥珀酸结合而使之脱氢，产生抑制作用，且抑制程度取决于琥珀酸与抑制剂在反应体系中浓度的相对比例，所以这种抑制是竞争性抑制。本实验通过观察在由不同浓度的琥珀酸与丙二酸组成的反应体系中使等量甲稀蓝退色反应时间，从而验证丙二酸对琥珀酸的竞争性抑制作用。 【实验用品】 1、试剂 （1）0.10mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）:0.1mol/L NaH2PO419ml 加 0.1mol/LNa2HPO481ml。 （2）0.093mol/L琥珀酸钠溶液：取琥珀酸钠1.5g溶于100ml蒸馏水中。 （3）0.10mol/L丙二酸钠溶液：取丙二酸钠1.5g溶于100ml蒸馏水中。 （4）0.02%甲稀蓝溶液。 （5）液体石蜡。 2、器具 （1）0.10mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）：0.1mol/L NaH2PO419ml加0.1mol/LNa2HPO481ml。 （2）0.93mol/L琥珀酸钠溶液：取琥珀酸钠1.5g溶于100ml蒸馏水中。 （3）0.10mol/L丙二酸钠溶液：取丙二酸钠1.5g溶于100ml蒸馏水中。 （4）0.02%甲烯蓝溶液。 （5）液体石蜡。 2、器具 （1）恒温水浴箱　　　　　　（2）研钵或组织匀浆机 【实验操作】 新鲜免肝立即剪碎，放于组织匀浆机中研碎，加入pH7.4的0.10mol/L磷酸盐缓冲液，制备成200g/L的肝匀浆液备用。取五支试管分别编号，按下表配制反应体系： 试剂 管号 0.093mol/L 琥珀酸钠 0.10mol/L 丙二酸钠 0.10mol/L(pH7.4) 磷酸缓冲液 肝匀浆液 0.02% 甲烯蓝 1 — 1ml 2ml 1ml 3滴 2 1.5ml 0.5ml 1ml 1ml 3滴 3 1ml 1ml 2ml — 3滴 4 2ml — 1ml 1ml 3滴 5 1ml 1ml 1ml 1ml 3滴 将各管溶液混匀后加一薄层液体石蜡后静置（此时不可摇动!），观察各管中的颜色变化，并记录各管颜色完全变化的时间。 【思考题】 1、抑制的分类及其特点？ 2、本实验中液体石蜡起什么作用? 3、各管中的反应体系配好后为什么不能再摇动? 4、制备肝浆时用磷酸缓冲液，可否换用蒸馏水，为什么？