氨基酸分离鉴定——纸层析法.pptVIP

氨基酸的分离鉴定——纸层析法 一、实验目的 掌握氨基酸纸层析的方法和原理，学会分析待 测样品的氨基酸成分。 二、实验原理 纸层析是以滤纸为惰性支持物的分配层析。滤纸纤维上的羟基具有亲水性，吸附一层水作为固定相，有机溶剂为流动相。当有机相流经固定相时，物质在两相间不断分配而得到分离。 溶质在滤纸上的移动速度用Rf值表示： Rf=原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离 在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。 三、实验器材 （1）大烧杯 （2）毛细管 （3）喷雾器 （4）培养皿 （5）层析滤纸 （6）直尺、铅笔：自备。 （7）鼓风干燥箱 （8）订书机 （9）塑料薄膜 （10）小烧杯 四、实验试剂 （1）扩展剂：将4体积正丁醇和1体积冰醋酸放入分液漏斗中，与5体积水混合，充分振荡，静置后分层，弃去下层水层。 （2）氨基酸溶液：0.5%的已知氨基酸溶液5种（赖氨酸、脯氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸及其它们的混合液（各组分浓度均为0.5%）。 （3）显色剂：0.1%水合茚三酮正丁醇溶液。 实验试剂 五、实验操作 检查培养皿是否干燥、洁净；若否，将其洗净并置于干燥箱内120℃烘干。 （1）平衡：剪一大块塑料薄膜铺在桌面上，将层析缸或大烧杯倒置于塑料薄膜上，再把盛有约20mL展层溶液的小烧杯置于倒置的层析缸或大烧杯中，用塑料薄膜密封起来，平衡20min。 （2）规划：带上手套，取宽约14cm、高约22cm的层析滤纸一张。在纸的下端距边缘2cm处轻轻用铅笔划一条平行于底边的直线A，在直线上做6个记号，记号之间间隔2cm，这就是原点的位置。另在距左边缘1cm处画一条平行于左边缘的直线B，在B线上以A、B两线的交点为原点标明刻度（以厘米为单位），参见左图。 （3）点样：用毛细管将各氨基酸样品分别点在这6个位置上，干后再点一次。保证每点在纸上扩散的直径最大不超过3mm。 （4）层析（扩展）：用订书机将滤纸订成筒状，纸的两侧边缘不能接触且要保持平行，参见上图。向培养皿中加入扩展剂，使其液面高度达到1cm左右，将点好样的滤纸筒直立于培养皿中（点样的一端在下，扩展剂的液面在A线下约1cm），罩上大烧杯，仍用塑料薄膜密封。当上升到15～18cm，取出滤纸，拆开钉子，立即用铅笔描出溶剂前沿线，迅速放鼓风干燥箱热风吹干。 （5）显色：用喷雾器向滤纸上均匀喷上0.1%茚三酮正丁醇溶液，然后置于烘箱中烘烤5分钟（100℃）或者立即用热风吹干，即可显出各层析斑点，参见左图。 （6）计算各种氨基酸的Rf值，并判断混合样品中都有哪些氨基酸，各人将自己的实验结果贴在实验报告上。 计算 纸层析结果 * * 计算 Rf=原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离 ?