羟自由基诱导肿瘤细胞凋亡的检测.docVIP

羟自由基诱导肿瘤细胞凋亡的检测 1. 实验目的 通过实验了解细胞凋亡的一般过程和形态特征，了解诱导细胞凋亡的因素；学习和了解细胞凋亡检测的常规手段，掌握利用梯状DNA电泳法鉴定细胞凋亡的方法。 2.实验原理 细胞凋亡是多细胞生物体在发育过程中或在某些环境因子的作用下发生的受基因调控的主动的死亡方式。对于生物体的正常发育、自稳平衡及多种病理过程具有极其重要的意义。细胞凋亡（apoptosis）的概念最早由Kerr于1972年提出，当时用来描述某些类型的细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，主动地结束其生命，最终脱落离体或裂解为若干凋亡小体（apoptotic body）而被其细胞所吞噬的过程。细胞凋亡的主要特征包括：染色质凝集、质膜出芽、核裂解及凋亡小体的形成。DNA特异性降解成180～200bp或其整数倍片断，通过凝胶电泳形成梯状条带，称为DNA Ladder。由于DNA特异性降解而产生大量3’-OH末端，可被末端脱氧核糖核苷酸移换酶介导的dUTP缺口末端原位标记法（TUNEL）标记，从而产生亮绿色荧光等。1980年，Wyllie在研究糖皮质激素诱导胞腺细胞凋亡时发现内源性核酸内切酶活化及其引起的一系列形态学和生物化学方面的变化，提出了细胞程序化死亡（programmed cell Death, pCD）的概念。细胞的程序性死亡通常采取细胞凋亡的形式，因此严格地讲细胞凋亡和程序性死亡并不是同一概念。凋亡主要是形态学方面的函义，而程序性死亡则侧重于功能方面。但是通常人们并未加以严格区分而将这两个概念等同使用。 细胞凋亡是多种生理、病理因子参与的由凋亡相关基因启动的细胞程序性死亡过程，其中由氧应激造成大量活性氧（reactive oxygen species, ROS）的产生以及继发性细胞损伤过程在细胞凋亡中起着重要作用，如电离辐射或紫外线照射产生大量H2O2、OH等。造成的细胞凋亡。有关活性氧诱导细胞凋亡的详细分子机制尚未得到阐明，部分学者根据一些实验提出了相联系关的假说进行了一些解释。 人工诱导细胞凋亡所使用的OH可以通过Fenton反应而得到，即使用Fe2+与H2O2反应而生成。一般在实验室中，采用一定浓度的FeSO4与H2O2进行。该反应经ESR证实可以在30min内持续稳定地产生OH。 3. 实验用具及材料 Hela细胞系、普通光学显微镜、荧光显微镜、载玻片、盖玻片、细胞培养瓶、生理盐水、电泳仪、高速离心机、紫外检测信、超净工作台、二氧化碳培养箱、恒温水浴锅、细胞记数器、DMEM培养基（GIBOCO公司）、溴酚蓝指示液、台盼蓝染色液（20.0g/L生理盐水配制）、DAPI染料、（4,6-diamidino-2-phenylindole）(Sigma公司)、TUNEL检测试剂盒（Boehringer Mannheim公司）青霉素、链霉素、Rnase A、硫酸亚铁（FeSO4）、双氧水（H2O2）、50xTAE缓冲液、PBS缓冲液、裂解液等。 4. 实验方法及步骤 1）细胞培养 Hela细胞培养在DMEM高糖培养基中，接种密度为1×104个/mL。培养基含有体积分数10%的胎牛血清、100U/mL青霉素、100(g/mL链霉素。细胞在37℃、体积分数5%CO2的条件下进行培养。定期观察、传代。当细胞生长到对数期时进行诱导凋亡的实验。 2）细胞凋亡的诱导 培养的细胞处于对数生长期时，在无菌操作台内将一定浓度的FeSO4与H2O2加进培养瓶。细胞处理的参考浓度如下： 组别 FeSO4/umol/L H2O2/umol/L 对照组 0 0 处理1 100 300 处理2 100 600 处理3 100 900 3）细胞凋亡的检测 （1）台盼蓝染色（Typan blue）检测细胞死亡率 因为生活状态的细胞，其细胞结构完整，所以台盼蓝染料分子不能进入细胞内部。在光学显微镜下观察细胞不着色。而坏死细胞的细胞膜出现破裂或细胞膜通透性提高，台盼蓝染料可以进入细胞内部，因此死亡的细胞呈蓝色。细胞在凋亡过程中膜系统保持完整，因此台盼蓝染色细胞保持无色。 方法：①将培养的Hela细胞取出，加2～3滴细胞悬液于干净的载玻片，滴加一滴台盼蓝染色液，染色1min后即可在显微镜下观察。 ②选定细胞分散良好的视野，进行细胞死亡率的统计 细胞死亡率=死亡的细胞数目/统计的所有细胞数目 （2）DAPI荧光检测 利用DAPI染料与细胞核内的DNA的结合，在紫外光的激发下发出荧光。因而在荧光显微镜下可以检测细胞核形态的变化。 ① 将生长在盖玻片（预先用1mg/mL多聚赖氨酸处理）上的细胞进行Fe2+/H2O2的诱导。 ② 用预冷的D-Hanks液洗2遍。 ③ 甲醇固定30min。 ④ 用D-Hanks液洗1遍。 ⑤ 加入1μg/ml DAPI染