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第二讲 转基因的方法 几个基本名词 限制性内切酶 限制酶的全称是限制性内切核酸酶，顾名思义，这是切割核酸的酶，可以把一切个分子切割成两段或若干段，但这种酶在核酸分子内切割时又不是乱剪乱，是有限制的。 限制酶把DNA分子分开的地方，叫做酶切位点，凡是称为酶切位点的DNA片段，核苷酸对的排列比较特殊，那就是一条链上的核苷酸排列顺序正好是它的互补链的180 倒转。由于这个特点，酶切位点的这段DNA所包括的两条互补链，都顺着一个方向读，即从5 3 ，或3 5 读，两条链的顺序是完全一样的。例如有一段DNA,上面的核苷酸对是这样的 5 GAATTC 3 3 CTTAAG 5 你从5 3 读，上下两链都是G-A-A-T-T-C。这种排列顺序特称为“回文序列”（图2.1）。 限制性内切核酸酶的种类很多，一种内切酶只能在一种回文序列处剪开DNA,就是说不同的内切酶，具有不同的酶切位点。（表2.1）。 表2.1 一些常见的限制酶的识别位点 限制酶 识别位点 限制性 识别位点 ApaI Bg1II ClaI 5G GGCC C3’ 3’C CCGG G 5’ 5’ A GATC T 3’ 3’ T CATC A 5’ 5’ AT CG AT 3’ 3’ TA GC TA 5’ SmaI TagI Sau961 5 CCC GGG 3’ 3’GGG CCC G 5’ 5’ T CG A 3’ 3’ A GC T 5’ 5’ G GNC C 3’ 3’ C CNG G 5’ * 表中 N 表示任意碱基。 双链被内切酶切开后，必然留出两个单链末端，一段具有5 GAATTC 3回文序列的双链DNA，被一种称为EcoRI的限制酶从G-A之间切开后，就留下两个-T-T-A-A-单链末端。这种末端是不稳定的，单链上的核苷酸全按照A接T、G接C这样的原则去粘连上对方的核苷酸，为此，把单链末端特称为“黏性末端”。 同一种内切酶只能在一种回文序列处切开DNA双链，同一种酶切开双链后留下的黏性末端是相同的，而有时候，内切酶虽不同，却也会把双链DNA切成相同的单链末端，这种切出相同黏性末端的不同酶，互相称为同尾酶。 连接酶 连接酶的全称是DNA连接酶。一看就知道，这种酶的作用就是把那些被内切酶切成一段段的DNA连接起来，这种酶好像是专门用来连接DNA的“浆糊”或“胶水”。 连接酶也有不同种类，黏性大小也因种类而异。目前称得上连接DNA“强力胶”的连接酶是T4DNA连接酶。 同一种内切酶切成的DNA片段被连接酶连成一体后，如果再用这种内切酶切割，那么又会再次切成原来的两段，而连接酶把同尾酶切成的两段DNA连成一体后，那么连接处就不会被其中任何一种同尾酶再度切开。 连接酶也会把平头末端的DNA片段连在一起。 载体 载体的完整名称是基因载体。基因要转移，尤其是远距离的转移，没有运输工具是不能达到目的的。目前能把基因运往“异国他乡”的运载工具主要是质粒和噬菌体。 质粒（plasmid）是什么？原来质粒本身也是一个DNA分子，但是作为质粒的DNA分子比一般作为染色体组成物的DNA分子要小得多，而且质粒DNA分子是一个环状分子。这种环状的DNA分子主要在细菌、蓝藻细胞内。质粒能自由进出细胞，质粒DNA的基因也能决定性状，质粒DNA在细胞内也能复制。像大肠杆菌这样的细菌因为有质粒的存在会表现出新的性状，而新性状会因质粒离开细胞而消失。如质粒DNA上有一个抗青霉素的基因，那么，可以预料，当质粒进入大肠杆菌后，大肠杆菌就抗青霉素，而质粒离开大肠杆菌后，大肠杆菌就会被青霉素杀灭。 由于质粒本身具备进出细胞的能力和自我复制的功能，于是就有人想让质粒来运载基因了。经过摸索，最终得出的结论是，质粒确实能作为运载基因的工具，但只能运载分子结构小于10kb的基因，10kb就是10千碱基，即一万个碱基对的DNA，对质粒来说还运得动。当比一万个碱基对还要大时，质粒就无能为力了。 现在，已有许多质粒被用来运载基因了，虽然质粒的种类不同，但不同种类的质粒却有许多共同点，这些共同点是：要有回文序列（酶切位点），要有抗性基因，要有复制开始的核苷酸序列（复制起始点）。 一种名为pBluescript的质粒（图2.2），标明MCS的地方，就是酶切位点。在这里集中着多个酶切位点，也就是说，在这里有多个回文序列，MCS的中文意思是多克隆位点，英文全称是Multiple clone site。 内切酶能在MCS处把环状质粒切开，并留下两个黏性末端，如果用同样的内切酶去切割其他来源的DNA，那么势必会把其他来源的DNA切成具有两个与质粒相同的黏性末端，如果两个黏性末端之间的DNA中正好有一个能生产蛋白质的基因，而这种蛋白质正好是人们所需要的，那么这个基因就