产毒副溶血性弧菌快速检验方法.docVIP

ICS点击此处添加ICS号 点击此处添加中国标准文献分类号 SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T XXXXX—XXXX 产毒副溶血性弧菌快速检验方法 The rapid detection of toxigenic Vibrio Parahaemolyticus 本稿完成日期：2013-04-18 XXXX - XX - XX发布 XXXX - XX - XX实施 中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局发布 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009《标准化工作导则》给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国云南出入境检验检疫局，中华人民共和国上海出入境检验检疫局，上海交通大学，上海市临床检验中心，昆明市西山区疾病预防控制中心。 本标准主要起草人：陈丽萍，刘忠民，张继伦，陈芸，彭云霞，史贤明，王大鹏，王庆忠，王珏。 产毒副溶血性弧菌快速检验方法 范围 本标准第一法规定和适用于副溶血性弧菌及携带致病因子（tdh和trh）产毒副溶血性弧菌三重PCR快速检测方法和结果判定；第二法规定和适用于副溶血性弧菌及携带致病因子（tdh）产毒副溶血性弧菌双重荧光PCR快速检测方法和结果判定。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T4789.7 食品卫生微生物学检验 副溶血性弧菌检验 WS/T81 副溶血性弧菌食物中毒诊断标准及处理原则 SN/T 0173 出口食品中副溶血性弧菌检验方法 SN /T2142 国境口岸副溶血性弧菌感染监测规程 SN /T1193 基因分析检测实验室技术要求 GB 15981 消毒与灭菌效果的评价方法与标准 GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法（GB/T 6682-1992.neq ISO 3696:1987） GB 19489 实验室 生物安全通用要求 SN /T 2102（所有部分）食源性病原体PCR检测技术规范 SN/T 2424 进出口食品中副溶血性弧菌快速及鉴定检测方法 实时荧光PCR方法 GB/T 4789.1 食品卫生微生物学检验 总则 术语和定义 产毒副溶血性弧菌 toxicity vibrio parahaemolyticus 含有致病因子（例如tdh和trh等）的副溶血性弧菌。若人食用携带产毒副溶血性弧菌食品后，极可能出现腹痛、腹泻(大多为水样便，重症者为粘液便或粘血便)、恶心、呕吐、发烧等中毒症状。 高风险食品 high dangerous foods 国境口岸生产经营、进出境的海产品(如鱼、虾、蟹、贝类)和腌醉制生食动物性食品。 水体 water bodies 国际海港水域水体、国际运输交通工具上压舱水、水产品养殖及暂养用水。 DNA deoxyribonucleic acid 脱氧核糖核酸 多重PCR 是在同一个反应体系中加入一对以上的引物，同时检测几个目标基因的PCR方法。 TaqMan实时荧光PCR polymerase chain reaction 使用荧光素标记的实时荧光聚合酶链反应。 tdh thermostable direct hemolysin 副溶血性弧菌耐热溶血毒素所对应的基因。 trh tdh-related hemolysin 副溶血性弧菌耐热直接溶血毒素相关溶血毒素所对应的基因。 tlh thermolabile hemolysin 副溶血性弧菌不耐热溶血毒素所对应的基因。 gyrase 旋转酶对应的基因。本标准扩增的相应片段为副溶血性弧菌的保守片段。 Ct值 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 检测对象 国境口岸和出入境腹泻人员粪便、呕吐物或肛拭，高风险食品，及需要检测的其他样品。 第一法 产毒副溶血性弧菌三重PCR快速检测方法 方法原理 携带致病因子的副溶血性弧菌是产毒副溶血性弧菌。根据FDA 2004标准推荐的扩增副溶血性弧菌tdh和trh致病基因的引物序列信息，以及行标SN/T 2424-2010推荐的扩增副溶血性弧菌保守gyrase基因的引物序列信息，合成引物，按照本标准优化的反应体系比例将这三对引物加入一个PCR反应管中，再加入反应试剂和提取的样品DNA，按照本标准优化的反应条件进行特异性扩增，根据扩增条带的大小（gyrase 91 bp；tdh 269 bp；trh 485 bp），判定样品中是否含有副溶血性弧菌以及含有的副溶血性弧菌是否为携带tdh和或trh致病因子的产毒副溶血性弧菌。 培养基、试剂和耗材 除另有规定外，所使用的试剂为分析纯