变性蛋白的免疫沉淀方法.docVIP

变性蛋白的免疫沉淀 当蛋白质处于正常天然构象 A.所需溶液和试剂 注意：所有溶液均需要用Milli-Q超纯水或是相当纯度的其他水配制。 变性细胞裂解液：50 mM Tris (pH 7.5), 70 mM β-巯基乙醇 (β-ME)。β-ME需新鲜加入，加入后先煮10分钟。 细胞裂解液 (1X): 20 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2.5 mM sodium pyrophosphate, 1 mM β-glycerophosphate, 1 mM Na3VO4，1μg /ml Leupeptin. 注意：使用之前加入1 mM PMSF。 蛋白A琼脂糖微球：取1.5 g 蛋白A琼脂糖微球加入到5 ml的1X PBS中。4°C缓慢搅拌2小时。离心沉淀微球，用PBS清洗两次。将微球重悬在1倍体积的PBS中。（处理后的微球可以在4°C存放2周） 3X SDS上样缓冲液：187.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 25°C), 6% w/v SDS, 30% 甘油, 150 mM DTT, 0.03% w/v溴酚蓝。 B. 细胞裂解样品制备 吸去培养基。加入含调控因子的新鲜培养基，处理所需的时间。 在非变性条件下收集细胞，弃去培养基，用PBS清洗一次。 弃去PBS，每个板（150 x 25 mm）中加0.4 ml变性细胞裂解液（使用前预煮10分钟）。 立即将所有细胞刮下，收集到2.5 ml的管中。 沸水中煮10分钟。 加入4倍体积（1.6 ml）冰冷的1 X细胞裂解液。所得即细胞裂解物。如有必要，样品裂解物可以保存在–80°C。 C. 免疫沉淀 将一抗加入到200 μl细胞裂解物中，在4°C的转子上孵育过夜。 加入20 μl 50%浆状的蛋白A琼脂糖微球。在4°C的转子上孵育1~3个小时。 4°C离心30秒。沉淀用500 μl细胞裂解液洗五次，洗完置于冰上。 将沉淀用20 μl 3X SDS上样缓冲液重悬沉淀。涡旋震荡，离心30秒。 把样品放在95–100°C加热2-5分钟。 取15-30 μl样品，上样到SDS胶（12–15%）上。 Western免疫印迹分析检测（参考 Western Immunoblotting方法）。