酶联免疫吸附测定肿瘤坏死因子试剂盒操作中标本的收集.docVIP

上海恒远提供：肿瘤坏死因子试剂盒实验操作步骤 酶联免疫吸附测定肿瘤坏死因子试剂盒操作中标本的收集 用于ELISA测定的临床标本最为常用的是血清(浆)，有时因为特定的检测目的，也用到唾液、脑脊液、尿液、粪便等标本。目前使用血清(浆)标本测定的标志物一般有传染性病原体的抗原和抗体、肿瘤标志物、激素、特种蛋白、细胞因子和治疗药物等。 对用于激素和治疗药物测定的血清标本的收集，要注意收集时间甚或体位有可能会对测定结果产生影响。如可的松在早晨4：00—6：00之间，会有一峰值出现；生长激素、促黄体激素(LH)和促卵泡激素(FSH)均以阵发性方式释放，因此，在测定此类激素时，有必要在密切相连的时间间隔内采取数份血样本，以其中间值为测定值。 又如当从卧位变为站立位时，血清中肾素活性将出现明显增高。再如治疗药物的检测，应根据药代动力学选择服药后的最适时间抽血检测。用于传染性病原体的抗原和抗体、肿瘤标志物和特种蛋白等的检测的血清标本的收集则没有时间和体位方面的影响。 ELISA试剂盒操作步骤： 方法一　用于检测未知抗原的双抗体夹心法 　　1.　包被：用0.05MPH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃ 过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。（简称洗涤，下同）。 　　2.　加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃ 孵育1小时。然后洗涤。（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）。 　　3.　加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度）0.1ml。37℃ 孵育0.5～1小时，洗涤。 　　4.　加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃ 10～30分钟。 　　5.　终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。 　　6.　结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm（若以ABTS显色，则410nm）处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。 方法二　用于检测未知抗体的间接法 　　1.用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg/ml，每孔加0.1ml，4℃过夜； 　　2.次日洗涤3次； 　　3.加一定稀释的待检样品（未知抗体）0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤； 　　4.（同时做空白、阴性及阳性孔对照）于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体（抗抗体）0.1ml； 　　5.37℃孵育30-60分钟，洗涤； 　　6.’最后一遍用DDW洗涤。 　　其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。 试剂 　　（1）　包被缓冲液（PH9.60.05M碳酸盐缓冲液）: 　　Na2CO3 1.59克 　　NaHCO3　2.93克 　　加蒸馏水至1000ml 　　（2）　洗涤缓冲液（PH7.4PBS）：0.15M 　　KH2PO4 0.2克 　　Na2HPO4·12H2O　2.9克 　　NaCl　8.0克 　　KCl　0.2克 　　Tween-20　0.05%　0.5ml 　　加蒸馏水至1000ml 　　（3）　稀释液： 　　牛血清白蛋白（BSA） 0.1克 　　加洗涤缓冲液至100ml 　　或以羊血清、兔血清等血清与洗涤液配成5～10%使用。 　　（4）　终止液（2M　H2SO4）： 　　蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸（98%）21.7ml。 　　（5）　底物缓冲液（PH5.0磷酸枣柠檬酸）: 　　0.2MNa2HPO4（28.4克/L）25.7ml 　　0.1M柠檬酸（19.2克/L）　24.3ml 　　加蒸馏水50ml。 　　（6）　TMB（四甲基联苯胺）使用液: 　　TMB（10mg/5ml无水乙醇）0.5ml 　　底物缓冲液（PH5.5）　10ml 　　0.75%H2O2　32μl 　　（7）　ABTS使用液: 　　ABTS　0.5mg 　　底物缓冲液（PH5.5）　1ml 　　3%H2O2　2μl 　　（8）　抗原、抗体和酶标记抗体。 （9）　正常人血清和阳性对照血清。 器材 　　（1）　聚苯乙烯塑料板（简称酶标板）40孔或96孔，ELISA检测仪，50μl及100μl加样器，塑料滴头，小毛巾，洗涤瓶。 　　（2）　小烧杯、玻璃棒、试管、吸管和量筒等。 　　（3）　4℃冰箱，37℃孵育箱。 实验条件的选择 　　在ELISA中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括: 　　（1）　固相载体的选择：许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和