实验五微核检测技术.docVIP

实验五 微核检测技术 一、目的 1. 了解微核测试原理和毒理遗传学意义。 2. 学习小鼠骨髓细胞和蚕豆根尖的微核测试技术。 二、原理 微核（micronucleus, 简称MCN），也叫卫星核，是真核类生物细胞中的一种异常结构，是染色体畸变在间期细胞中的一种表现形式。微核往往是各种理化因子，如辐射、化学药剂对分裂细胞作用而产生的。在细胞间期，微核呈圆形或椭圆形，游离于主核之外，大小应在主核1/3以下。微核的折光率及细胞化学反应性质和主核一样，也具合成DNA的能力。一般认为微核是由有丝分裂后期丧失着丝粒的染色体断片产生的。有实验证明，整条染色体或几条染色体也能形成微核。这些断片或染色体在分裂过程中行动滞后，在分裂末期不能进入主核，便形成了主核之外的核块。当子细胞进入下一次分裂间期时，它们便浓缩成主核之外的小核，即形成了微核。已经证实，微核率的大小是和作用因子的剂量或辐射累积效应呈正相关，这一点与染色体畸变的情况一样。所以许多人认为可用简易的周期微核计数来代替繁杂的中期畸变染色体计数。由于大量新的化合物的合成，原子能的应用，各种各样工业废物的排出等都存在污染环境的可能性，欲了解这些因素对机体潜在的遗传危害，需要有一套高度灵敏，技术简单易行的测试系统来监测环境的变化。只有真核类的测试系统更能直接推测诱变物质对人类或其它高等生物的遗传危害，在这方面，微核测试是一种比较理想的方法。目前国内外不少部门已把微核测试用于辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、新药试验、食品添加剂的安全评价，以及染色体遗传疾病和癌症前期诊断等各个方面。 70年代初，Matter和Schmid首先用啮齿类动物骨髓细胞微核率来测定疑有诱变活力的化合物，建立了微核测定法。此后，微核测定逐渐从动物、人扩展到植物领域。人和动物的微核测试多用骨髓和外周血细胞，这需要一定的培养条件与时间，细胞同步化困难，微核率低，一般只在0.2%左右。而植物系统则更直接、更简便。如采用高等植物花粉孢子利用其天然的同步性作微核测试材料，取得较好效果，其中70年代末Te-Hsiu Ma用一种原产于美洲的鸭跖草（Tradescantia paludosa），建立的四分孢子期微核率计数（MCN-in-tetrad）的测试系统是较好的系统之一。华中师范大学生物系自1983年开始，建立了一套蚕豆根尖微核测试，并首次用于监测水环境污染，经鉴定已列入国家《生物监测技术规范（水环境部分）》。 本实验介绍了小鼠骨髓细胞微核测试和蚕豆根类微核测试技术。 三、实验内容 （一）小鼠骨髓细胞的微核测试 骨髓细胞微核测定的阳性药物可用环磷酰胺，为加强阳性效果，剂量可适当加大。给药途径视实验要求而定。 1. 实验材料 成年小鼠，雌雄均可。 2. 器具和试剂 显微镜、刻度离心管、吸管、载玻片、离心机、注射器、烧杯、解剖器具。环磷酰胺（1mg/ml）溶液、生理盐水、小牛血清（或1%柠檬酸钠溶液）、甲醇、1/15mol/L磷酸缓冲液（pH 6.8）、Giemsa原液。 3. 实验步骤 （1）按40(g/g体重的剂量对小鼠腹腔注射环磷酰胺溶液诱发微核（若进行其它因子测定或自然环境测定按下线步骤直接操作）。 （2）处理24～36小时后，小鼠采用脱颈椎处死，迅速剥取两根股骨，剔净肌肉等软组织，并擦净股骨上的血污。 （3）剪去肌骨两端关节头，用注射吸收2～3ml预温到37℃的生理盐水，然后将针头插入股骨腔，尽量将骨髓细胞冲洗出来，置于10ml试管中把细胞团用吸管吹打散，然后将细胞悬液转入离心管内，弃去残渣。 （4）1000rpm离心5分钟，收集细胞，弃去上清液，尽量不留残液。滴加2～3滴灭活小牛血清，将细胞轻轻吸打均匀。 （5）1000rpm离心5分钟，收集细胞，弃去上清液，再加1滴灭活小牛血清，用吸管轻轻混匀。 以上两步的小牛血清亦可用1%檬檬酸钠代替，但注意两步须在15分钟内完成。 （6）滴一小滴细胞悬液在清洁的载玻片上，涂成均匀涂片，在空气中干燥。 （7）放入甲醇中固定10分钟，干燥后，用不着：9Giemsa染液（1份原液，9份pH 6.8磷酸缓冲液）染色10分钟，迅速用缓冲液洗片，让其干燥，即可用于观察。 4. 实验结果 选择细胞密度适中，铺展均匀，染色良好的地方，随机观察计数。骨髓细胞中有核的细胞均可见到微核，但是在只有少量孢浆的有核细胞微核细胞常很难与正常核叶及核的突出物相鉴别。而在无核的嗜多染色细胞的胞浆中，微核却易于辨认。因为嗜多染色细胞为骨髓细胞中一类主核刚被排出的年幼红细胞，在它完成最后一次有丝分裂后几小时将其主核排出，而由染色体断片形成的微核则保留在细胞中。因此一般观察计数嗜多染色红细胞中的微核。 嗜多染红细胞经Giemsa染色呈灰蓝色，成熟红细胞呈枯红色。微核大多数呈圆形或椭圆形，边缘光将整齐。嗜染性与核质一样，呈