预先静脉应用曲马多对急性心肌缺血大鼠心肌保护作用的研究.docVIP

预先静脉应用曲马多对急性心肌缺血大鼠心肌保护 及NF-κB调节作用的研究 张林忠 郭政 山西医科大学麻醉学系，山西医科大学第二医院麻醉科（山西太原，030001） 1.引言 曲马多作为中枢性镇痛药，临床多用于中重度的疼痛治疗。研究表明曲马多对于急性心肌缺血再灌注损伤有心肌保护作用[1]，而对于急性心肌缺血过程中心肌保护方面的研究却较少且机制不清楚。NF-κB是一种具有多向性调节作用的核转录因子，在缺氧、氧化应激等情况下，通过一系列细胞信号转导引起NF-κB活化，促进炎性介质如TNF-α、ICAM-1、IL-2、IL-1等转录表达增加，加重组织器官功能的损伤。目前研究认为在心肌缺血再灌注损伤、高血压心脏病、心肌炎等过程都有NF-κB参与[26]。探索其可能的机制NF-κB表达活化及其转录调节的靶基因之一ICAM-1表达的影响。2. 材料与方法 2.1实验动物健康成年雄性SD大鼠，体重250-300g山西医科大学实验动物中心提供。动物随机分为三组：1) 假手术组(Sham group, S组)；2) 结扎冠状动脉组Coronary artery occlusion group, CAO组；3) 静脉注射曲马多组Intravenous injection Tramadol group, T+CAO组结扎左冠状动脉前15min经尾静脉给予曲马多12.5mg.kg-1。2.2心肌缺血大鼠模型制备 用25％的乌拉坦腹腔注射60mg.kg-1，ip麻醉大鼠后，固定于实验台，连接肢体心电监测作Ⅱ导联心电图。颈部行气管切开插管后，进行人工机械通气（RR 70bpm,VT8ml.kg-1）然后在左侧胸壁第4-5肋间旁开胸骨正中线1cm处沿肋间开胸，暴露心脏，以左冠状静脉主干为标志，在左心耳下方2mm处进针，用0/6无损伤线穿过心肌表层的肌肉，在肺动脉圆锥旁出针，结扎冠状动脉左前降支，并计时。结扎后支配区心肌由红色变白，大鼠心电图ST段明显抬高，确认结扎成功，将心脏放回原位关胸，负压吸引将胸腔内空气抽出,大鼠恢复自主呼吸脱离呼吸机。每小时经尾静脉补生理盐水1ml。所有动物均心肌缺血6h后，行深度麻醉后采集标本。 2. 大鼠心脏TTC染色及缺血区测定 CAO组和T组4只大鼠，在6h采集标本前经尾静脉快速注入1%伊文斯蓝2ml，看到嘴唇及四肢掌部蓝染后迅速取出大鼠心脏，吸水纸将心脏表面的液体吸干净，迅速置入-70冷冻取出-70保存的心脏，剔除左心室以外部分，将左心室垂直于心脏纵轴方向自心底向心尖平均切成5-6片，置于1%TTC triphenyltetrazolium chloride)中37避光孵育10-15min后，用4%多聚甲醛固定24-48h。正常心肌仍保持蓝色，梗塞区心肌组织为白色，危险区心肌组织为红色。用扫描仪对心脏切片进行扫描，利用图像分析软件Image J 1.40 分别测定蓝色区、红色区及白色区域的面积。左心室面积left ventricle, LV)为蓝色、红色、白色面积之和，危险区总面积area at risk, AAR)为红色与白色面积之和，梗塞区面积area of infarction，AI为白色区面积。计算危险区总面积占左心室面积的百分比AAR/LV)和梗塞区面积占危险区总面积的百分比(AI/AAR)作为统计学指标。2.4 Real Time RT-PCR 取各实验组大鼠心脏立即置于无RNA酶4℃生理盐水中，漂洗干净后，迅速取缺血区心肌组织50-100mg，液氮rizol抽提组织总RNA，异丙醇沉淀，无RNase水溶解所得RNA。紫外可见光分光光度仪纯度。采用TIANScript反转录试剂盒进行RNA的反转录， ul的反应体系600ng总RNA42℃ 50min，95°C 5min反应结束后迅速将离心管冷却后-70°C冷冻保存。以核糖体蛋白L32（Rpl32）为看家基因，用Real time RT-PCR方法测定NF-κB p65mRNA和ICAM-1 mRNA的相对表达。Rpl32NM_013226)上游引物为5-CACAGCTGGCCATCAGAGTCA-3，下游引物为5-AAACAGGCACACAAGCCATCTATTC-3，扩增产物83bp; NF-κBp65 (NM_199267) 上游引物为5-TGAAGAAGCGAGACCTGGAG-3，下游引物为5-AGGGGTTATTGTTGGTCTGGAT-3，扩增产物为145bp; ICAM-1 (NM_012967) 上游引物为5- GCTTCTGCCACCATCACTGTGTA -3下游引物为5- AGCGCAGGATGAGGTTCTT -3, 扩增产物97bp。所有引物均由上海英骏生物技术公司合成将cDNA样品和连续四次10倍稀释的cDNA样品共五个依次加入P