高血压易感基因CYP4F2转基因小鼠模型的鉴定及CYP4F220.docVIP

附件2 论文中英文摘要格式 作者姓名：刘晓亮 论文题目：高血压易感基因CYP4F2转基因小鼠模型的鉴定及CYP4F2/20-HETE途径的作用机制研究 作者简介：刘晓亮，女，1981年5月出生，2005年9月师从于中国医科大学赵彦艳教授，于2010年6月获博士学位。 中 文 摘 要 目 的 细胞色素P450 4F2（cytochrome P450 4F2, CYP4F2）通过ω-羟化作用将花生四烯酸（arachidonic acid, AA）代谢为20-羟基二十碳四烯酸（20-hydroxyeicosatetraenoic acid, 20-HETE），是人类肾脏产生20-HETE最主要的酶。20-HETE通过调节血管和肾小管的活性而影响动脉血压：一方面，20-HETE收缩外周血管，并增强其它血管活性物质的缩血管效应而起促高血压作用；另一方面，20-HETE抑制肾脏近端小管和髓袢升支粗段对钠离子的重吸收而起抗高血压作用。本课题组前期对辽宁省西部高血压病高发区人群的关联研究表明，CYP4F2基因调控区功能性多态上调了该基因转录活性，增强了代谢产物20-HETE的生成，与高血压发病呈正相关。我们的结论与Ward等对白种人群报道的CYP4F2 V433M多态与20-HETE生成增多及血压升高呈正相关结论一致。然而，Gainer等则认为20-HETE的另一合酶CYP4A11 F434S多态性降低了转录活性，与高血压呈负相关。因此，建立高血压易感基因CYP4F2的转基因小鼠模型，将是从整体水平分析20-HETE对血压的调节作用及机制的重要手段。 肾脏雄激素调节蛋白（kidney androgen-regulated protein, KAP）是小鼠肾脏近端小管表达的高丰度蛋白，与人CYP4F2在肾脏的表达部位基本一致。KAP启动子活性受雄激素、雌激素等多种激素的调节，其中以对雄激素的反应性最为明显。已有学者建立KAP-hAGT、KAP-LUC 等转基因小鼠模型，并成功地实现了雄激素对转基因在小鼠肾脏的诱导表达。因此，选择KAP启动子构建CYP4F2转基因小鼠模型，旨在强调CYP4F2在小鼠肾脏的优势表达，兼顾20-HETE的双重血压调节作用，并为实现CYP4F2的雄激素诱导表达提供可行性。 本研究通过建立CYP4F2转基因小鼠模型，从整体水平鉴定CYP4F2/20-HETE代谢通路对血压的调节作用，并进一步以该模型作为研究平台，借助雄激素诱导CYP4F2的表达及效应，为阐明CYP4F2/20-HETE对高血压的具体调节机制提供有力的条件。 材料与方法 一、实验材料： 1、FVB/N小鼠 2、人HEK293、HUVEC细胞系 3、基因克隆及萤光素酶报告基因检测相关试剂 4、Southern blot、Western blot及免疫组化相关试剂 5、20-HET EELISA检测、醛固酮放免检测相关试剂 6、Real-time PCR相关试剂 7、ROS特异性荧光染料DHE及NO特异性荧光染料DAF-2 DA 8、MDA及SOD检测相关试剂 9、氧化应激基因mRNA芯片 二、实验方法： 1、构建pKAP-LUC、pKAP-CYP4F2/his载体，转染人肾脏细胞系HEK293，双萤光素酶检测系统检测LUC活性，以CYP4F2抗体和his标签抗体Western blot检测CYP4F2的表达，细胞水平判断KAP启动子活性。 2、将pKAP-CYP4F2/his载体双酶切线性化，胶回收纯化转基因片段，显微注射至FVB/N小鼠受精卵，产生CYP4F2转基因Founder小鼠。提取鼠尾DNA，以CYP4F2特异性探针及引物，经Southern blot及PCR双重鉴定阳性小鼠，建立转基因系。 3、提取小鼠肾脏等十余种组织的总蛋白并定量，his标签抗体Western blot检测CYP4F2的表达谱。以4%多聚甲醛固定肾脏等组织块，石蜡切片，免疫组化鉴定CYP4F2的表达定位。提取肾脏微粒体蛋白，his标签抗体Western blot检测CYP4F2在微粒体酶中的表达。 4、将肾脏微粒体蛋白与AA底物、NADPH辅酶等成分孵育，建立体外的AA羟化反应体系，ELISA试剂盒检测20-HETE生成量。收集小鼠尿液，ELISA试剂盒检测尿20-HETE的水平。 5、无创鼠尾血压仪测量转基因小鼠收缩压（SBP），并抽样以有创的颈动脉插管法评估前种方法的有效性。动态监测8-40周龄小鼠的血压变化情况。小鼠眶后静脉丛采血并分离血浆及血清，放射免疫法测量血浆醛固酮水平，干片法测量血清肌酐（CRE）、尿素氮（BUN），判断肾功能。 6、对雌性转基因小鼠连续两周腹腔注射雄激素诱导剂5α-双氢睾酮（dihydrotestosterone，DHT），his标签