兔辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢-还原酶的功能性表达、纯化及活性鉴定.DOCVIP

临床医学论文-兔辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶的功能性表达、纯化及活性鉴定 【摘要】? 目的：用原核蛋白表达系统对兔辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶(NRDR)进行功能性表达，并对其活性进行鉴定。方法：从兔肝中克隆出NRDR全长序列，运用Gateway表达系统将其编码区序列构建到表达载体(pDEST 17)上，再转化到大肠杆菌(E.coli)(BL21_AI)中表达出兔NRDR蛋白并鉴定其表达形式；取工程菌裂解上清通过金属离子亲和层析纯化出目的蛋白，再运用反相高效液相色谱法(HPLC)测定该酶的Km值和Vmax值。结果：构建出含兔NRDR编码区(768bp)的表达克隆，转化到BL21_AI中表达出氨基端含6×His标签的重组兔NRDR蛋白，诱导表达4h后目的蛋白可占总蛋白量的414%；经一步亲和层析得到的兔NRDR纯度为972%，比活性提高了64倍；经HPLC测定，该酶对视黄醛的Km值为(455±033)μmol/L，Vmax为(0307±0065)μmol/(min·mg)。结论：应用pDEST 17可在BL21_AI中对兔肝NRDR进行高效的功能性表达。 【关键词】? 辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶 表达 纯化 类视黄醇代谢 ??? ［Abstract］Objective: To express the rabbit NADP(H)_dependent retino