五章文库的构建(小结).pptVIP

R 12 5’ GATCTGCGGTGA 3’ 3’ CTAGACGCCACT 5’ 　 R 24 5’ TGCGGTGAGAGGCTGGAGAGTGCT 3’ 3’ ACGCCACTCTCCGACCTCTCACGA 5’ 两个缺陷性λ噬菌体株 两个噬菌体株都在编码噬菌体蛋白外壳的某一组分基因带有一个突变位点： 一个突变发生在D基因上； 另一个突变发生在E基因上。 合成driver and tester cDNA Dpn II酶切两组双链cDNA R24、R12 及DNA 连接酶 连接Dpn II酶切的cDNA 　　 以R24 为引物分别PCR扩增处理组和对照组 用Dpn II 充分酶切, 切掉R24的接头, 即得到扩增子作为driver 更换接头, 连接J24、J12 到扩增子, 建立1个试验者群体。 Tester以1∶100 分子比例与driver 混合, 在95～ 96℃变性, 67℃杂交, 在两cDNA 群体间成对比较 用J24引物PCR扩增, T:D 呈线性递增, 产物单链DNA , T:T 杂交体呈指数递增, 且为dsDNA 分子, D:D 杂交不能进行PCR 扩增 第六章 重组DNA导入宿主 转化 转导 转染 感染 结合 其它 一、转化 transformation 一种遗传转移方式 1928年 Griffith 首次发现 肺炎双球菌（Diplococcus pneumoniae） 少量无毒RII（无荚膜，粗糙） 大量杀死有毒SIII（有荚膜，光滑） 混合注射小白鼠 ?鼠死?可分离出活SIII细胞 RII细胞 + SIII DNA 即一来自一个细菌细胞(供体)的DNA(片段)被另一个细胞(受体)所吸收(随后同受体染色体一起进行重组) 对DNA的吸收，仅在受体生长周期中的一个短暂阶段。能够吸收DNA的细胞，称作感受态细胞(competent cell) 在转化中有功能的DNA是双链或ssDNA， 线状或环状 （一）CaCl2转化法 核心，目标细胞在CaCl2·H2O溶液中浸泡一段时间 E.coli：100mM E.coli: DH5?, TG1, XL-1Blue, JM105 冰上30min 热激42℃ 90〃 恢复 1～2min 复苏 37℃ 45-60 min 转化效率107-109 cell/?gDNA 转化子（transformant） 转化后的受体菌，称转化子 （二）原生质体转化法 protoplast G+细菌，特别是芽胞杆菌，酶母 Lysozyme / 等渗环境下，脱细胞壁 ?细胞壁再生 (三)电转化法（electroporation） 10%甘油或蔗糖，含(或不含)Mg2+ 离子 2.5 KV/0.4cm 25?F 200-400? Gene Pulse, Bio-Rad 公司 电转杯 由噬菌体将细菌基因由一个细菌（供体）转移到另一个细菌（受体）的过程 二、转导（transduction） （一）普遍性转导 (generatized transduction) phage在供体中烈解中，部分供体DNA被包装，当感染受体菌时，若感染变数小于1时，缺陷phage可将供体DNA注入受体(此时原phage DNA不感染) ?形成新的表型 但这种表型不一定稳定，因为供体DNA不一定与受体发生重组，故此类转导称流产转导（abortive transduction），否则称完全转导(complete transduction) (二) 局限性转导 Specialized (or restricted) transduction ? phage 不正确切离时以10-6比率 产生?dgal （半乳糖基因）或?dbio（生物素基因） 以温和噬菌体为媒介，将供体细菌染色体的特定部分转移给受体细菌的过程。 噬菌体DNA直接参与了转导过程。 ? ?dgal 双重溶源菌进入裂解状态可产生两种噬菌体 感受态细胞经分离出来的噬菌体核酸所感染，随后能产生出正常噬菌体后代，叫转染 三、转染 (transfection) 这一过程与转化是相同的， 区别：使用的质粒载体换成了噬菌体。 转染； 体外包装 A. 缺陷性λ噬菌体 B.两个缺陷性λ噬菌体株 * 基因文库（Gene library）：由大量的含有基因组DNA（即某一生物的全部DNA序列）的不同DNA片段的克隆所构成的群体, 称之为基因文库。一个完全的基因文库，应该能够保证从中筛选到目的基因。 即 Genom