2012年酵母蔗糖酶的提取、分离纯化及其蛋白质浓度和酶活力测定(12.6).pptVIP

实验十 酵母蔗糖酶的提取、分离纯化及其 蛋白质浓度和酶活力测定; 蔗糖酶催化底物蔗糖分解成葡萄糖和果糖 蔗糖酶在酵母细胞中存在着两种形式 : 存在于细胞膜外细胞壁中的高度糖基化的外蔗糖酶，其活 力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50％（质量分数）糖成 分的糖蛋白，该酶是蔗糖酶的主要形式 存在于细胞膜内侧细胞质中的低糖基化的内蔗糖酶。 ;; 酶是生物体内具有催化活性的物质，可据酶蛋白的结构和性质来选择分离提纯方法和含量测定。 酶的分离提纯是为了提高纯度（或比活力）及收率；依据其性质（分子大小、溶解度、电荷、吸附等）进行分离; 同时用测定酶活力的方法了解酶的去向、衡量酶提纯的程度和得率。;本实验由四个分实验组成：;分实验一：蔗糖酶的提取与初步纯化;二、实验原理 细胞破碎的方法;蛋白质的沉淀 蛋白质从溶液中以固体状态析出的现象 　作用机制主要是破坏了蛋白质水化膜或蛋白质所带的电荷 主要沉淀方法： 　盐沉淀蛋白质——盐析 重金属盐沉淀蛋白质 某些酸类沉淀蛋白质 有机溶剂沉淀蛋白质 ; 乙醇、甲醇、丙酮等有机溶剂可破坏蛋白质的水化层，使蛋白质的溶解度下降；另一方面有机溶剂能降低溶液的介电常数，增加蛋白质分子上不同电荷的引力，降低其溶解度，因此使之发生沉淀反应。如把溶液的pH 值调节到该蛋白质的等电点时，则沉淀更完善。 在室温条件下，有机溶剂沉淀所得蛋白质往往已发生变性。 若在低温条件下进行沉淀，则变性作用进行缓慢。;利用机械法（二氧化硅研磨）破碎酵母细胞壁 采用预冷的去离子水溶解破壁后释放出来的蔗糖酶 离心去除酵母菌体而得到蔗糖酶溶液 加热去除热不稳定的杂蛋白 乙醇沉淀获得粗提酶。;;四、操作步骤 提取 （1）准备冰浴，将研钵稳妥放入冰浴中 （2）称取3g干酵母粉和5g 二氧化硅(石英砂)，放入研钵中 （3）用量筒量取30mL预冷的去离子水，先加5ml左右研磨（若不够每次用滴管再加2mL左右水）， 边加边研磨成糊状（至少用30 min），然后转移到100mL离心管中,最后用剩余的水洗净研钵中的物质并转移到离心管中，以便将蔗糖酶充分转入水相中。 ;;（4）平衡，4℃、10000rpm离心10min （5）将上清液倒入量筒，量出体积并记录，转入清洁烧杯中。 （6）用pH试纸检查上清pH值，用1mol/L 乙酸将pH值调至5.0。 （7）将其置于50℃的水浴，经常缓慢搅拌，30min。 （8）于冰浴中迅速冷却，倒入100ml的离心管中，4℃，离心 10分钟。 （9）取上清液，量体积并记录，得粗酶液1，同时预留2.0 ml 测定用。;乙醇沉淀;分实验二：蔗糖酶各级分酶活力的测定;二、实验原理;+;在酸性条件下，蔗糖酶催化蔗糖水解，生成葡萄糖和果糖。 葡萄糖、果糖和碱性铜试剂混合加热后被其氧化，二价铜 被还原成棕红色氧化亚铜沉淀。 氧化亚铜与磷钼酸作用生成蓝色溶液，其蓝色深度与还原 糖的量成正比，于650nm测定光吸收值。 ;三、试剂;四、仪器;五、酶活力测定的步骤;;一个酶活力单位Units定义为在给定的实验条件下， 每分钟能催化1μmol蔗糖水解所需的酶量 ;稀释后酶液的活力(按还原糖计算)： ;分实验三：蔗糖酶各级分的蛋白含量测定 （G-250法）;1.标准曲线的制作（选用0.5cm比色皿）;计算：;分实验四：离子交换柱层析纯化蔗糖酶;二 、实验原理;三、试剂;四、仪??;五、操作步骤;2. 上样与洗脱 ; 将2-3mL醇级分2用移液管沿着管壁轻轻加到 层析柱中，注意不要扰动柱床，上样后，用大约 30ml缓冲液洗去柱中未吸附的蛋白质，当A280nm 值降低稳定后，可用恒流泵及梯度混合器进行梯度 洗脱 [梯度混合器左侧放入50ml 0.02 mol/L pH值 为7.3的Tris-HCl缓冲液（含1 mol/L NaCl）， 右侧放入等量0.02 mol/LpH值为7.3的Tris-HCl 缓冲液]。; 连续收集洗脱液，注意观察紫外检测仪的读值，注意标记其升高时对应的收集器中的试管，待蛋白峰过后A280nm值稳定后，记住标记此时对应的收集器中的试管。 最后用0.02 mol/L pH值为7.3的Tris-HCl缓冲液 （含2 mol/L NaCl）洗层析柱，洗去所有吸附在柱子上的物质。 ;分组：