蛋白激酶CK2α′亚基相互作用蛋白筛选及相关深入研究.pdfVIP

蛋白激酶CK2Q’亚基 相互作用蛋白的筛选及相关深入研究 中文摘要 ‘ 背景与目的：蛋白激酶CK2是一种真核细胞中普遍存在的信使非依赖性丝 ／苏氨酸蛋白激酶。CK2是由两个催化亚基(c【和c【’)和两个调节亚基(13)组 因表达，蛋白合成，细胞周期，细胞生长及分化，同时还参与如癌症发生，抗 凋亡等病理过程。2003年已报道CK2有多达307种作用底物，其中243种得 到体内实验确证，许多新的CK2底物还在不断地被发现。CK2在睾丸及脑组织 中活性最高，睾丸组织中CK20【’亚基水平是脑组织的两倍；CK213亚基比脑组 织高3～4倍，比其它组织高将近8～10倍。因此本研究拟从人睾丸cDNA文库 中，利用酵母双杂交系统筛选与蛋白激酶CK2et’亚基相互作用的蛋白。方法： 构建于pACT2质粒(酵母双杂交中的AD质粒)的人睾丸eDNA文库和本室已 成功构建的BD质粒共转染感受态酵母菌AHl09后得到的初筛候选阳性克隆， 从这些候选克隆中，通过转化大肠杆菌JMl09获得单一文库质粒，再进行自主 激活报告基因检测和一对一回复性杂交实验，最后筛选出真阳性克隆(即与人蛋 白激酶CK2a’相互作用的蛋白)。经上述一对一回复确证为阳性相互作用的AD ● 质粒。以pACT2质粒的通用引物为测序引物测定该质粒的插入片段eDNA序列。 通过国际互联网络，以美国国立生物信息中心烈CBI)的BLAST作为主要的检 ■ 索工具，检索主要程序采用BLAST，对相互作用蛋白的eDNA序列进行同源性 分析，最终确定该相互作用蛋白的名称。通过原核表达获得阳性克隆蛋白，用 以进一步证实CK2a’与阳性克隆蛋白间的相互作用。结果：(1)经过酵母双杂 交实验，筛选出10种与蛋白激酶CK2et’相互作用蛋白，核酸序列分析及同源性 检索结果为：①人CK213亚基；②人COP9组成性光形成性同源亚基5；③人 基质蛋白3；④人核酸酶敏感元件结合蛋白1；⑤人核转换蛋白1；⑥人9KD 癌症／睾丸相关蛋白；⑦人线粒体细胞色素氧化酶III；⑧人依莫帕米结合蛋白(异 构酶)以及两个未知功能蛋白。(2)人9kD癌症／睾丸相关蛋白的原核表达及 Western blotting检测。结论：用酵母双杂交系统从人睾丸cDNA文库中筛选出 8种与人蛋白激酶CK2a’相互作用的已知蛋白和2种未知功能蛋白。成功进行了 人9Kd癌症／睾丸相关蛋白的原核表达及Westem blotting检测。 关键词：0【’催化亚基／蛋白激酶CK2／人；酵母双杂交系统；蛋白质相互作用； DNA序列测定；同源性检索；原核表达 、 中图分类号： Q55 ◆ ● theinteractionwith kinase Screening proteinsprotein CK2e’subunitanditsfurther study Abstract and Protein