转番木瓜环斑病毒（PRSV）复制酶突变体（RP）基因番木瓜选育、抗病机理及安全性分析.pdf

中山大学博士学位沦文 因番木瓜的选育、抗病机理及安全性分析 专业：环境科学 博士生：魏祥东 导师：蓝崇钰教授 中文摘要 随着转基因植物的发展，越来越多的转基因植物进入田间释放和商业化生 产，转基因食品也逐渐走上人们的饭桌。然而，越来越多的研究表明，转基因植 物给人类带来了巨大恩惠的同时，也可能带来了潜在的风险，可能对自然生态环 境和人类健康产生潜在危胁。为了安全、合理、科学地应用转基因植物，通过合 理的实验设计和严密科学的实验程序对其进行安全性评价和检测是必要的。本论 文以转基因番木瓜为材料，运用传统的微生物技术、分子生物技术和荧光定量 RT-PCR技术等技术手段，在对转基因番木瓜遗传稳定性及抗病机理的研究基础 上，较系统地研究了转基因番木瓜的环境安全性及食品安全性。取得的主要研究 结果如下： 建立了一种转基因植物及食品的检测方法；并对该方法的可操作性、准确性 及实用性进行了验证。通过实验证实该检测方法既可检测绝大多数转基因植物及 食品，又具有简便易行、经济节时、准确灵敏的优点。用建立的检测方法对田间 生长的转基因番木瓜进行分子生物学检测，检测结果表明，外源基因f衣壳蛋白 基因，CP和复制酶突变基因，RP)已经整合到番木瓜基因组中，并能稳定地遗 传给后代，且能在RNA水平上表达，因而使转基因番木瓜后代也具有较强的抗 病性。研究还发现，转CP基因番木瓜的抗病性及遗传稳定性较差，因而在筛选 过程中逐渐被淘汰；而转RP基因番木瓜抗病性较强，因而筛选获得的抗病转基 因番木瓜新品系全部为转RP基因番木瓜。 魏祥东 转番木瓜环斑病毒(PRSV)复制酶突变体(RP)基因番木瓜的选育、抗病机理及安全性分析 抗病机理进行了研究。研究发现，尽管RP基因在转基因植株中大量表达，但因 其表达产物(mRNA)被快速、大量降解，因而含量很低，所以不能被检测。进 一步研究表明，转基因番木瓜的抗病机制是共抑制，而引起RP基因表达产物 (mRNA)降解的主要原因是RNA干涉。 由于插入了外源基因，使转基因番木瓜生理生化活性及结构都发生了改变， 但与亲本非转基因番木瓜相比，转基因番木瓜果实的园艺性状及营养成分都无显 著性差异，即与亲本具有实质等同性。 在实验室条件下，土壤中加入转基因番木瓜DNA或叶片后，土壤中细菌数 量、抗性细菌数量和抗性商f抗性平板上的菌落数与无抗生素平板上的菌落数的 比值)都显著性增加，且加入转基因番木瓜DNA后，对土壤细菌数量、抗性细 菌数量和抗性商的影响比加入转基因番木瓜叶片大。转基因番木瓜在盆栽和田间 种植后，对土壤理化性质、土壤微生物的种类、数量和多样性及土壤酶活性产生 了较大影响。盒栽和田问种植转基因番木瓜后，土壤中有机质和主要矿质营养元 素f氮、磷、钾、钙、镁和硫)的含量都显著性下降，但与亲本相比，仅氮和硫 的含量有显著性差异。种植转基因番木瓜后，土壤细菌、放线菌和真菌的数量、 抗性微生物(细菌、放线菌和真菌)的数量及抗性商都显著性增加。转基因番木 瓜对不同土壤酶的活性影响显著性不同。种植转基因番木瓜后，土壤中碱性磷酸 酶、蔗糖酶、磷酸酶和硫酯酶的活性显著性增加，而多酚氧化酶和尿酶的活性显 著性下降，蛋白酶的活性也显著性改变，但无规律，对酸性磷酸酶和脱氢酶的活 性则没有显著性差异。在不同土壤基质中种植转基因番木瓜后，对土壤理化性质、 微生物数量、抗性商和土壤酶活性的影响都显著不同；而且在同种土壤基质中种 植不同品种的转基因番木瓜后，对土壤生态系统产生的影响也显著不同。进一步 研究转基因番木瓜对土壤细菌种类及多样性的影响发现，种植转基因番木瓜后， 对土壤细菌的种类和多样性的影响较大，使部分细菌类群消失(Verrucomicrobia and 的序列出现了严重分化。从各种土壤细菌的数量来看，种植转基因番木瓜后，土 木瓜种植于土壤中或土壤中加入转基因番木瓜DNA或叶片后，对土壤生态系统 都会产生显著性影响。 转基因番木瓜DNAf提取的或降解产生的)进入土壤后，一般可以在土壤保 留3．6月，有的甚至可保留2年以上，且纯化的DNA比降解产生的DNA在土 壤中保留活性时间更长、数量更多。研究发现，DNA在土壤中保留时间和数量 II