HLA-A＊0206-BSP和-A＊0207-BSP融合基因的构建与表达.pdfVIP

维普资讯 《现代免疫学}2007年第 27卷第 5期 HLA—A*0206一BSP和一A*0207一BSP融合基因的构建与表达 朱丽君，梁兵，梁智辉，李佳楠 ，张彩娥 ，翁秀芳，吴雄文 (华 中科技大学 同济医学院免疫学系，武汉 430030) 摘要 ：采用 RT—PCR技术从 HIAA*0206和 A*0207阳性个体 的PBMC中分别克隆出HIAA*0206和 A*0207基 因的 全长 cDNA序列，构建 HIAA*0206和一A*0207克隆载体 。再利用 PCR技术从构建的克隆载体 中扩增 HIAA*0206和 A*0207的a链(重链)胞外段序列，分别经双酶切置换本室保存 的HI，AA*0201一BSP重组体 中的 HI，A—A*0201胞外段 序列，使 HIAA*0206和一A*0207与 BirA酶底物肽(BirA substratepeptide，BSP)序列融合 ，构建 HI，A—A*0206BSP 和一A*0207一BSP融合基因的表达载体 ，经限制性酶切和 DNA测序证实。然后将该表达载体转化 E．coliBI21(DE3)后获得 表达产物 ，通过体外稀释复性 ，初步纯化的表达产物通过 El，ISA和 Westernblot检测证 明能够与 13微球蛋 白(HIA I类分 子轻链)及 HIA—A2限制性抗原肽(HBVcore1827)折叠形成具有 HIA I类分子天然构象的抗原肽 ／HIAA2复合物单体 。 为进一步构建 HIA—A*0206和一A*0207四聚体 ，探讨相应 HIAA2亚型的功能特点提供了物质基础 。 关键词 ：克隆；HIA—A*0206和 A*0207；生物素化序列 中图分类号 ：R394．4 文献标识码 ：A 文章编号 ：1o01_2478(2007)050412一O6 主要组织相容性分子 (MHC)在免疫应答 中起 人 首次建立 pMHC四聚体技术 以来 ，pMHC四 着十分重要的作用 ，其主要生物学功能是将抗原肽 聚体广泛应用于抗原特异性 T细胞的检测和分离 提呈给 T细胞识别 。MHC分子具有高度 的多态 上。四聚体是通过生物素与亲合素 4：1的特异性结 性，多态性 的氨基酸残基常位于抗原肽结合槽 ，使 合关系，将 4个生物素化的pMHC单体与标记 的 MHC分子的型别影响对抗原肽的结合和提呈，从 亲合素结合形成的复合物 。近年来 ，pMHC单体 而影 响 T细胞应答 。HIA—A2为最常见的 HIA I 或多聚体也应用于激活或扩增抗原特异性 T细胞 类分子型别 ，HIAA2阳性个体约 占人群的 50 。 上，例如将 pMHC单体或多聚体和抗 CD28抗体 HIAA2包括 多达 75种亚 型，其 中 HIAA * (或 B7分子)包被在细胞大小 的微球上 ，使之成为 0201，一A*0206， A*0207三个亚型的基因频率 能够为T细胞活化提供第一和第二信号的人工抗 最高 ]。不同 HLAA2亚型分子 的重链之间只有 原提呈细胞 (APC)L5j。为了探讨各种 HIA—A2亚 一 或几个氨基酸存在差异，例如 HIA—A*0201在 型的功能特点 ，由相应 HIA—A2亚型分子组成的 第 9位和第 99位分别为非极性疏水性 的脯氨酸与 pMHC单体或 四聚体是不可或缺 的工具。因此 ， 极性芳香族的酪氨酸，而 A*0206的第 9位氨基 本研究在 克隆 出人 PBMC中 HIA—A*0206和一A 酸为有较强极性的酪氨酸 ，A*0207第 99位氨基 *0207的全长基 因的基础 L，将 HIA—A*0206 酸为极性较弱的半胱氨酸 。这导致各亚型对抗原肽 和 A*0207的胞外 区序列置换 HIA—A *0201一 的提呈效率 的差异和特异性 CTL对其反应 的差