铜绿假单胞菌生物膜形成影响因素及相关基因的研究.pdfVIP

铜绿假单胞菌生物膜形成影响因索及相关墓因的研究 中文摘要 背景 细菌生物膜 (Biofilm,BF)是细菌枯附于物体表面，并分泌大量多糖、蛋 白和DNA等多聚物质，将自身包裹于其中而形成的复杂膜状结构。生物膜是细 菌的一种保护性生长模式，广泛存在于自然界。细菌也可定植于植入物、留置导 管或人体组织表面形成生物膜。生物膜内的细菌生物学特性与普通浮游细菌有显 著差异，它具有极强的对外界化学物质的耐受性和抵抗宿主免疫系统的能力，是 临床仁难治性感染的一个重要原因。近年来随着医学的发展，各种人工器官和留 置导管使用的日益增多，生物膜相关感染也在不断增加，因此，研究生物膜形成 影响因素及机理对于生物膜相关感染的防治具有重要意义。 第一部分 铜绿假单胞菌生物膜分析方法的研咒 目的 筛选一种有效且简单易行的生物膜分析方法 方法 分别采用流动培养 法和静止培养法建立生物膜模型，用4种不同的方法分析:共聚焦激光扫描显微 镜 (CLSM)法、扫描电镜法、结晶紫染色法和超声振荡一活菌计数法分析生物 膜的形成情况，CLSM观察生物膜的形态结构和厚度，扫描电镜法观察生物膜的 形态结构，结晶紫染色法检测吸光度值，超声振荡一活菌计数法计数生物膜内的 活细菌数。分别将扫描电镜法、结晶紫染色法、超声振荡一活菌计数法所反映生 物膜形成情况与CLSM结果相比较。 结果 CLSM观察显示24h生物膜内微菌 落呈稀疏散在分布，72h生物膜内细菌己形成微菌落，且许多微菌落己融合，形 成稳定成熟的生物膜结构;24h和72h生物膜厚度分别为27.61tm,64.61tm。扫 描电镜法显示72h生物膜表面有大量形状不规则的基质成分，细菌被包裹于其 中。结晶紫染色法测得8h,16h,24h,48h和72h的吸光度值分别为0.08土0.04, 0.20士0.07,0.41士0.33,0.47士0.33和0.6810.34，结果有统计学差异 (P0.001)a 超声振荡一活菌计数法24h和 72h的Log,OCFU/引导片分别为4.59士0.49和 5.2010.47，具有统计学差异 (P0.001)。结论4种方法均可反映生物膜的形成情 况，其中超声振荡一活菌计数法可定量分析生物膜，且结果重复性好，操作简便， 经济实用，因此是一种较为理想的生物膜分析方法。 第二部分 铜绿假单胞菌生物膜形成影响因素的研究 目的研究不同条件下铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa,PA)生物膜形成的 差别。方法 采用恒化器结合改良Robbins装置培养铜绿假单胞菌生物膜，用超 声振荡一活菌计数法检测不同培养时间 (8h,24h,72h)、不同温度 (230C,37 ℃)、不同粘附材料 (玻璃、硅胶)、不同液体流速 (30ml/h,90m1/h)和不同培 铜绿假单胞菌生物膜形成影响因素及相关从因的研究 养基 (M63,MH,LB)生物膜内活细菌数。结果 固定培养基、培养温度、培 养基流速及粘附材料，8h,24h和72h的生物膜内活菌数 (Log,OCFU/引导片) 分别为4.01士0.26,4.5910.49和5.2010.47,尸0.001;固定培养基、培养基流速、 培养时间和粘附材料，23℃和37℃形成的生物膜内活菌数 (Log,OCFU/引导片) 分别为5.12土0.43和5.3010.42尸=0.039;固定培养温度、培养时间、培养基及 培养基流速，生物膜引导片分别为玻璃和硅胶形成生物膜内活菌数 (Log,OCFU/ 引导片)分别为5.4910.59和6.21士0.40,P0.001;固定培养温度、培养时间、 培养基及粘附材料，培养基流速分别为30ml/h和90ml/h的生物膜内活菌数 (Log,OCFU/引导片)分别为5.4410.58和5.83士0.52,P=0.002;固定培养温度、 培养时间、培养基流速及粘附材料，分别以M63,MH和LB作为培养基形成的 生物膜内活菌数 (Log,oCFU/引导片)分别为6.01士0.75,6.24士0.42和6.6610.12, P0.001。结论 时间、温度、材料、流速和培养基均对铜绿假单胞菌生物膜有 一定的影响。 第三部分 铜绿假单胞菌生物膜形成相关基因的研R 目的 检测铜绿假单胞菌生物膜形成过程中相关基因的转录，探讨生物膜形成的 分子机制。方法 培养24h和%h铜绿假单胞菌生物膜和相应对数期浮游菌，提 取这些细菌的总RNA，进行反转录，运用半定量PCR技术扩增flits