杨梅Frankia菌多样性和nifHDK基因克隆及杨梅转基因研究.pdf

摘 要 rubraSieb．et 杨梅(Myrica Zucc)系我国特产水果，也是我国南方的一种 先锋树种。因其能与弗兰克氏(Frankia)放线菌共生在根部形成固氮根瘤，能将 大气中分子态的氮还原成氨供植物吸收利用，能在瘠薄土壤和较恶劣的环境中生 长，是改良土壤、治理水土流失、改善生态环境的优良经济生态林果，经济效益 显著且经济年限较长，已被国家林业局列为生态公益林备选树种之一。近年来， 随着产业结构的调整和山区综合开发，杨梅种植面积迅速扩大，增长势头非常强 劲，已成为山区开发的重要经济林树种。 氮素固定是我们这个星球上维持生产力的一个重要生态反应，生物固氮是解 决人类目前面一I毒人口、粮食、能源和环境这一总体问题的一个重要方面。如何充 分利用杨梅结瘤固氮特性，充分发挥其经济效益和生态环境效益，在衣业可持续 发展战略中显得尤为重要。 目前有关杨梅共生固氮的研究报道较少，为了更好地开发和利用杨梅共生固 氮特性，本论文围绕杨梅根瘤及其共生弗兰克氏菌进行了深入的研究，主要实验 结果如下： 1．杨梅根瘤尼1删a茴的分离鉴定．采集不同生态环境不同杨梅品种根瘤， 采用根瘤切片法和根瘤匀浆悬液法在不同的分离培养基上分离培养。对获得的放 线菌菌落进一步纯化，纯化后的茵落进行显微镜检查、固氮酶活性测定、革兰氏 染色鉴定，对部分茵株进行回接试验和PCR分子检测，获得了一些弗兰克氏菌株， 对其中的3个分离株进行回接试验，能使杨梅幼苗形成根瘤。Q“和J-A培养基是 分离杨梅根瘤弗兰克氏菌较好的培养基，且Q”培养基优于J-A培养基。分离株 在Q一培养基上表现不同的颜色，呈革兰氏阳性。茵丝分枝，有隔，直径为0．6～ 7—2．2m： 1．1¨m；在菌丝末端可以看到圆形顶囊结构，有隔或无隔，直径为1 u 5—30 m。这些分 孢子囊直径1 um，梨形或椭圆形；孢子圆形，直径1．4～1．7u 离林在无氮BAF培养基上表现出乙炔还原活性。 蛋白含量，研究了3个菌株的培养特性和碳源、氮源、pH值及温度对它们生长 基和BM+NZ扣FMS液体培养基中生长。它们分别以葡萄糖、丙酮酸钠(含量均为 (含量均为0。59／L)为唯一氮源时生长良好；能利用丙酸钠，但利用率低：且均 VlI 5℃一3 上，菌体生长受到抑制。MPCIl菌株在23℃生长良好，高于或低于此温度 范围，菌株生长受到影响。不同菌株菌落颜色和形态，菌丝体颜色、生长速度固 培养基种类的不同而有差异，且菌落和菌丝体的颜色也会随着培养时间的长短发 生变化。 3．杨梅根瘤弗兰克氏菌株对抗生素和重金属的抗性及其机理。采用生长抑 制分析法研究从杨梅根瘤分离的10个Frankia菌株对9种重金属元素的抗性， 0mmol／L)、 一般来说，所有供试菌株对H92+和Ag+敏感，大部分菌株对Pb”(5-1 2+ Cr 20，2一(5—10mmol／L)、As02一(5—1 0mm01／L)不敏感，部分菌株对cu”、Co”、Ni 金属的抗性存在较大差异，其中菌株MDA21对所有供试重金属都敏感，而菌株 MPAll几乎能抗所有供试重金属，且有几个菌株能同时抗多种重金属。低浓度的 铅能促进抗铅菌株的生长，而高浓度的铅对其生长有一定的抑制；抗铅菌株在含 铅的培养基中仍具有固氮酶活性，在一定浓度范围内，随着铅离子浓度的升高， 固氮酶活性有所增强。胁打七妇菌的抗铅机理可能是其具有结合或螯合铅离子作 用，对其他重金属的抗性机制尚不清楚。通过11个菌株对氨苄青霉素、利福平 和卡那霉素3种抗生素的敏感性试验，发现从杨梅根瘤分离的弗兰克氏菌株大多 数能同时抗氨苄青霉素和利福平，但对卡那霉素敏感。因此氨苄青霉素和利福平 可作为筛选采些菌株的选