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大菱鲆hepcidin基因在巴氏毕赤酵母中的表达研究 研究生 肖健康 生物物理专业 指导教师 曾宪垠研究员陈松林研究员 摘要 大菱鲆是从欧洲引进的一种名贵经济鱼类，又称“多宝鱼”，营养丰富、味道 鲜美、经济价值高，其养殖在我国已初步形成产业化，养殖前景看好。但目前大 菱鲆鱼病的防治主要是大量使用抗生素和一些重金属化合物(如孔雀石绿等)， 造成鱼类耐药性增强，药物残留及重金属残留严重超标，使大菱鲆养殖业受到严 重影响。因此，寻找新的抗生物质代替化学合成抗生素和重金属化合物的研究迫 在眉睫。 抗菌肽是一类具有广谱抗菌活性的小分子物质，是生物体天然免疫反应系统 的重要成员，在生物体抵抗外界病原物感染过程中起着非常重要的作用。抗菌肽 分布十分广泛，并且对真菌、大多数革兰氏阴性或阳性菌、原生动物都有抑制作 用，有些抗菌肽还具有抗寄生虫、病毒和肿瘤的作用。 母菌株x．33，通过对阳性转化子的表达情况进行分析，为开发转抗菌肽酵母作 为鱼类饵料添加剂的应用提供理论基础。主要内容及结论如下： 1．胞内表达载体的构建：提取大菱鲆肝脏总RNA并反转录成cDNA，根据 序列，并在目的片段后面加入凝血酶蛋白酶切位点。PCR得到的目的片段插入 巴斯德毕赤酵母胞内表达载体pGAPZB中，构建了重组胞内表达载体 p6APZB-TH。 2．表达载体的电转化及转化子的筛选：用BlnI单酶切重组表达载体后，用 5一lOug的线性化质粒与山梨醇法制备的巴氏毕赤酵母X-33感受态细胞混匀冰浴 经过Zeoci一抗性筛选和蜗牛酶法得到的转化子基因组PCR扩增筛选，分别得 到了3株阳性转化子酵母菌株和3株阴性对照菌株。 3．转化子Tricine r／min培养后用蜗牛酶法提取胞内蛋白，Tricine 菌株经过YPD培养基在30℃，250 SDS．PAGE电泳显示阳性菌株在5．8kDa处有蛋白条带出现，而阴性对照菌株和 中进行了表达。 4．阳性转化子时间表达动态：转化子菌株在培养过程中，按照时间点0、12、 24、48、72、96、120 h 体提取蛋白进行TricineSDS。阳性转化子时间表达结果显示：在0,-48 h 没有检测到外源蛋白的表达，在72h时，酵母胞内有微量的蛋白出现，在96 时表达量最大。 关键词：抗菌肽hepcidin，巴氏毕赤酵母，胞内表达 ofturbot inPichia Expressionhepcidingene pastoris Xiao Jiankang(Biophysics) Directed andProf．Chen bYProf．ZengXianyin Songlin Abstract rare from and form andeconomic Turbot,a fish,washoughtEuropeinitially industrializationbreedwithbroadoutlookforitsabundatnutritiondeliciousflavour nOWinthe andcureamofturbotdisease． and economicvalue．But prevention highly