肝脏星状细胞金属蛋白酶的表达调节及酶原活化机制的研究.pdf

延缓肝纤维化的发展提供实验依据。 /实验材料和方法 1.鼠HSC分离和培养:采用胶原震荡法进行分离鼠肝脏星状细胞。密 度梯度离心，加人DMEM并补充10%的小牛血清和抗菌素，在37-C,5% CO:条件下培养。1:3分配传代培养，5一10代细胞待用。 2.制作四种不同细胞外基质成分的培养基。聚苯乙烯培养基(PO),I 型胶原包被的培养基(C.C)、I型胶原凝胶培养基(C.G.)、含有IV型胶原 成分的Matrigel培养基(M.G.)。 3.鼠HSC的无血清培养:先将鼠HSC在含有10%小牛血清的DMEM 的四种培养基中培养3天后，弃上清，使用PBS缓冲液洗涤3次。为了避免 小牛血清自身分泌MMP-2,MMP-9酶的前体所致的干扰，将HSC换成无 血清培养，细胞洗涤后加人无血清的DMEM，再培养24小时后，收集培养上 清液，通过10,000rpm，离心5min，待用。 4.凝胶酶谱(Zymography)方法:收集无血清培养HSC培养上清，使用 舜胶酶谱立法A绽蜡养上清液中的MM”一,“MMP一”前件恻吵形盛， 5.Westernblot方法:在上述四种培养基培养HSC48小时后，收集不同 培养基中HSC,AWNM,EjfX0嘎百面Westernblot#JIT商培养 基中HSCMT,-MM凡瓤瘾熟盯es一一一一一一一 — 6.RT一PC板硫酥至压颐雨晤养基培养HSC48小时后，收集培养基 中HSC，采用RT一PCR同时检测细胞中MMP一2mRNA,MT，一MMPmRNA, TIMP一2mRNA水平的表达。并使用R一actin作为内对照。 7.所有RT一PCR产物用I%琼脂糖凝胶电泳检测。结果采用NIHIm- age计算机软件自动分析系统进行半定量分析。将四种不同培养基HSC细 胞MMP一2mRNA,MT，一MMPmRNA,TIMP一2mRNA的泳带灰度的相对值 比较，进行t检验。 实验结果: 1.HSC在上述四种培养基中培养后，proMMP一2可见于任何一种培 养基。MMP一2只见于I型胶原凝胶培养基中。在上述四种培养基中均未 见到proMMP-9和MMP一9。表明作为主要细胞外基质成分的三维结构 ·2 · 的I型胶原可以诱导HSC大量分泌proMMP一2并在细胞外转化为MMP- 2。而HSC在含W型胶原培养基上培养后，proMMP一2活性化受到抑制，因 而未见到活性化的MMP一20 2.MT，一MMP蛋白水平表达:Westernblot实验结果:四种不同条件培 养的HSC，其蛋白水平表达MT，一MMP模式不同，在聚苯乙烯培养基、I型 胶原包被培养基、1型胶原凝胶培养基中均有表达，但是只有在I型胶原凝 胶培养基表达明显增强(P0.01)。在含N型胶原培养基中未见表达。 3.HSC在上述四种培养基中培养后，MMP一2mRNA均可见表达，在I 型胶原凝胶培养基中可见MMP一2mRNA表达明显增强。含W型胶原培养 基中MMP一ZmRNA表达明显减弱。 4.MT、一MMPmRNA表达:HSC在上述四种培养基中培养后，均见表 达，只有在I型胶原凝胶培养基表达明显增强(P0.01)0 5.TIMP一2mRNA表达:HSC在上述四种培养基中培养后，均可见表 达，但是只有在I型胶原凝胶培养基表达明显增强(P0.01). 结 论 1.呈三维螺旋结构的I型胶原能够诱导HSC产生proMMP-2，并将其 活性化为MMP-2。非三维螺旋结构的单体I型胶原、IV型胶原可以诱导 HSC产生proMMP一2，但不能导致MMP一2产生。提示三维螺旋结构的I 型胶原是proMMP一2活化的前提条件。首次证明I型胶原的三维螺旋结 构对HSC产生MMP一2至关重要。 2.呈三维螺旋结构的I型胶原能调节HSC的生物学功能，诱导HSC MT，一MMP以及MT,一MMPmRNA同时高表达。 3.HSC在三维螺旋结构的I型胶原培养后，MMP一2mRNA,MT,- MMPmRNA,TIMP一2mRNA一致表达增强。提示proMMP一2激活有MT, 一MMP,TIMP一2基因水平的参与。 4.本研究在三维螺旋结构的I型胶原培养基