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源于原始生殖细胞的人、小鼠ES细胞的分离克隆 硕士研究生:华进联 指导教师:窦忠英教授 摘 要 本研究探讨不同饲养层、胎龄、细胞因子及添加物对PGCs源人、小鼠胚胎干 细胞处鱼克魔的影响，得到早期传代的人、小鼠类ES细胞. ·‘自9.5-13.5dpc小鼠胎儿PGCs获得早期传代类ES的胞系色·5-8.5及’4.5- 15.5即c小鼠胎儿原代培养观察到类ES细胞集落，16.5-18.Sdpc小鼠胎儿原代培养 ‘一二*，“* 一_、。‘、厂了 未观察到类ES细胞。厂’ 2.总共收集分离流产儿136例，其中110例4-13w胎儿中56例观察到类ES 细胞集落.39例做传代培养，H,:传至9代，7例传至5代以上。 3.自4-13w流产儿PGCs均可分离到人类ES细胞。5-10w流产儿最适于PGCs 源的人类ES细胞的分离克隆，5w以下或大于17w流产儿难于得到PGCs源的人 类ES细胞。 4.添加LIF(4ng/ml)+bFGF(4ng/ml)+SCF(20ng/ml)及谷氨酞胺 (2mM)，丙 酮酸钠 (IMM)、非必需氨基酸 (0.01mm)有利于PGCS源的人类ES细胞的分离 克隆。 5.MEF,bEF,hEF三种饲养层细胞对人PGCs体外培养均有促进作用.MEF 最适于人PGCs的体外培养，hEF对PGCs培养效果稍差于MEFe 6.本研究得到早期传代的PGCs源人、小鼠类ES细胞。具典型小鼠ES细胞 特征，核较大，细胞呈集落生长，典型集落呈鸟巢样，集落结构紧密，细胞间界限 不清，隆起，与周边细胞界限清晰:表现AKP阳性:悬浮培养或延迟传代培养能 分化形成类胚体或上皮样细胞，成纤维细胞，神经样细胞，观察到PGCs分化成的 心肌样跳动的细胞团，收缩频率60-120次//min,最长连续跳动IOdoHs3Hu,H78 部分冷冻细胞解冻后能重新形成类ES细胞集落。多项实验证明，本研究得到早期 传代的PGCs源的人类、小鼠ES细胞。 原始生殖细胞 人 小鼠 关键词 胚胎干细胞 例械之 IsolationandCloneHuman,Murine EmbryonicStem(ES)CellsDerived fromPrimordialGermCells GraduateStudent:Huajinliang DirectiveProfessor:Douzhongying Abstract Somefactorsinfluceningtheefficiencyoftheisolationandclone human,murineembryonicstem(ES)cellsderivedrfomprimordialgerm cellsandmouseembryonicstemcellshavebeeninvestigated,inclucling feederlayercells,gestationalage,cytokinesandothersupplements.The resultsobtainedwereasfollows: 1.Earlyembryonicstem-likecelllinescanbeisolatedandclonedrfom primordialgermcellsderivedrfomgonads,gonadalridges,analoguesorthe surroundingtissuesof9.5-13.5dayspostcoitum(dpc)mousefetuses.ES cell-likecoloniesareobservedatprimarypassageof7.5-8.5dpcand14.5- 15.5即cmousefetusesanddisappearedatlaterpassage.NoEScell-like coloniesareobservedatprimarypassageof16.5-18.5即