《多聚酶链式反应扩增DNA片段》文字素材2（人教版选修1）.docVIP

多聚酶链式反应扩增DNA片段 一、课题目标 本课题通过尝试PCR（DNA多聚酶链式反应）技术的基本操作，使学生体验PCR这一常规的分子生物学实验方法，理解PCR的原理，讨论PCR的应用。 二、课题重点与难点 课题重点：PCR的原理和PCR的基本操作。 课题难点：PCR的原理。 三、课题背景分析 课题背景首先介绍了PCR是一种在体外迅速扩增DNA片段的技术，然后说明这一技术在遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆等方面都有着广泛的应用，最后指出本课题的目标是了解PCR技术的基本原理，并尝试用PCR技术扩增DNA片段。教师在导入本课题的学习时，可以先让学生谈一谈对PCR的认识以及PCR的应用，以激发学生的学习兴趣，然后再说明本课题的目标。 四、基础知识分析与教学建议 （一）PCR原理 知识要点：1.细胞内参与DNA复制的各种组成成分与反应条件；2.DNA的合成方向；3.Taq DNA聚合酶的应用。 教学建议：理解PCR的原理，需要首先了解细胞内参与DNA复制的各种组成成分与反应条件。教师在教学过程中，可以首先引导学生回忆必修2《遗传与进化》中的有关DNA复制的知识。在此基础上，学生需要进一步了解DNA双链的方向，芄磺諨NA的3′端和5′端。此外，学生还需要了解DNA聚合酶的特性，如只能从DNA的3′端开始延伸DNA链、而不能从头合成DNA等。 Taq DNA聚合酶的应用，解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题，促成了PCR技术的自动化，是一个重要的知识点。教师可以结合专题2中课题2“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”Taq细菌的发现过程，帮助学生加深理解。 （二）PCR的反应过程 知识要点：PCR的基本步骤及每个步骤所发生的变化。 教学建议：这部分内容的教学应以读图识图为主。教科书中图5-9“PCR反应过程图解”详细地描绘了参与PCR的各组成成分；每一轮反应的三个基本步骤──变性、复性和延伸；每一轮中每一个步骤所发生的变化，即每个步骤所具有的作用。教师在教学中可以请学生在读图的同时，结合教科书中的文字说明来加深理解。当学生遇到难以理解的地方时，教师要及时给予解答。 五、实验案例 PCR扩增双歧杆菌编码16SrRNA的DNA片段 1.双歧杆菌的培养。本实验用双歧杆菌作为实验材料，需要在实验前一天培养双歧杆菌。双歧杆菌的培养基配方如下。 大豆蛋白胨5.0 g? 胰胨5.0 g??????? 酵母提取物10 g 葡萄糖10 g?????? 微量盐溶液40 mL? 半胱氨酸盐酸盐0.5 g 0.1%（0.1 g/100 mL）刃天青 1 mL 将上述物质溶解后，用蒸馏水定容至1 000 mL，调节pH至7.0。 其中，微量盐溶液的配方如下。 CaCl2 0.2 g? MgSO4·7H2O? 0.48 g? K2HPO4 1 g KH2PO4 1 g?? NaHCO3 10 g? NaCl 2 g 培养双歧杆菌24 h后，将菌液进行离心，双歧杆菌将沉淀在试管底部。 2．PCR操作。往双歧杆菌的沉淀中加入0.2 mL裂解液（裂解液配方为50 mmol/ L 的Tris-HCl , 0.5 %的Tween 20, 1 mg/ mL的蛋白酶K，pH为8.0），使细胞裂解，释放出DNA。将裂解液在55 ℃温度下加热孵育3 h后，再在95 ℃温度下加热10 min，然后立即放入冰水中冷却。冷却后离心，将10 μL上清液转移到0.5 mL的离心管中，然后依次加入10倍浓缩的扩增缓冲液5 μL、25 mmol/ L 的MgCl2溶液3 μL，20 mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液1 μL，Taq DNA聚合酶1 μL(2U/μL)，蒸馏水29 μL，两种引物(25 μmol/ L) 各0.5 μL。混匀后按教科书表格中的数据设定PCR程序，进行反应。 需要说明的是，进行本实验可以直接购买试剂盒，试剂盒的价格比单独购买试剂的价格要低，并且包括了PCR所需的所有试剂。但是，试剂盒上往往只标出了试剂号，而没有标明试剂的名称，因此购买时要进行详细的咨询。如果单独购买试剂，PCR所需的引物必须委托相关的试剂公司来合成，合成后必须低温保存，否则引物容易发生降解。本实验所用引物的碱基序列如下。 引物I 5′GGATTCTGGCTCAGGATGAACGG 3′ 引物II 5′CCGGGTGCTICCCACTTTCATGG 3′( I 代表碱基次黄嘌呤, 它可以与A、G、C、T中的任何1个碱基配对)。 3．PCR产物的检测。产物的检测除了可以采用教科书中提供的方法外，还可以采用琼脂糖凝胶电泳的方法。琼脂糖凝胶电泳的有关介绍可参见本专题中课题3《血红蛋白的提取和分离》以及本课题的参考资料，具体操作步骤如下。 （1）用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净，放在水平桌