猪脑心肌炎病毒SYBR GreenⅠ real-time PCR检测方法的建立.pdfVIP

中国兽医科学 2009，39(O2)：135—139 ChineseVeterinaryScience 中图分类号：S852．659．6 文献标志码 ：A 文章编号：1673—4696(2009)02—0135—05 猪脑心肌炎病毒 SYBRGreenIreal-timePCR 检测方法的建立 施开创 ，陈进喜。，屈素洁 ，许瑞胜。，熊 毅 ，刘 棋 ，陈汉忠。，李 刚 (1．中国农业科学院 北京畜牧兽医研究所 ，北京 100081；2．广西动物疫病预防控制中心， 广西 南宁 530001；3．广西大学 动物科学技术学院，广西 南宁 530005) 摘要 ：针对猪脑心肌炎病毒 (EMcV)VPI基 因序列设计并合成 了1对引物 ，以构建的含有该 引物扩增 序列的重组质粒作为阳性标准品，建立 了检测 EMCV核酸的 SYBRGreen工real—timePCR方法。检测结 果显示 ，该方法线性关 系好 ，标准 曲线的相关系数 达到0．991；对初始模 板的检 出下 限为 1×10 copies／uL， 比常规 PCR方法高 1O0倍 ；与其他猪源病毒，如 口蹄疫病毒 (FMDV)、猪生殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)、 猪瘟病毒 (CSFV)、伪狂犬病病毒 (PRV)均不发生交叉反应；组 内与组 问的变异 系数均小于 3％。应用建立 的方法检测 了17份临床可疑病例 的心、脑组织样本 ，结果 1份为阳性。表 明，建立的 real—timePCR检测方 法灵敏度高、特异性强、重复性好 ，可以用于 EMCV 的病原检测及定量分析 。 关键词 ：脑心肌 炎病毒 ；猪 ；荧光定量 PCR；SYBRGreenI DevelopmentofarealIt·imePCR assaybasedonSYBR GreenI fordetection ofporcineencephalomyocarditisvirus SHIKai—chuang ，CHENJin—xi。，QU Su—jie。，XU Rui—sheng。，XIONG Yi，LIU Qi， CHEN Han—zhong。，LIGang (1．InstituteofAnimalSciences，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Beijing100081，China；2．GuangxiCentre rAnimalDiseaseControlandPrevention，Nanning530001，China；3．CollegeofAnimalScienceandTechnology， GuangxiUniversity，Nanning530005，China) Abstract：A pairofprimerswasdesignedaccordingtothesequenceoftheVP1geneofporcineencep— halomyocarditisvirus(EM CV)andarecombinantplasmidcontaining thetargetgenewasconstructedasa standardcontro1．Then，areal—timePCR assaybasedonSYBR Green工 fordetectionofEMCV wasestab一 1ished．Ithadagood1inearrelationshipbetweeninitialtemplatesandC+values，andthecorrelationcoeffi— cientofthestandardcurvewas0．991．Theassayhadadetectionlimitofl×l0 copies／t,Lofinitialtem— plates，whichwas100timesmoresensitivethantheconventionalPCR．M oreover。theassayhadnocross— reactionwithFMDV ，PRRSV ，CSFV andPRV ，andhadacoefficientofvariationslessthan 3 forboth intra～andinter—assay．Se