糖基化在KSHV编码vGPCR中功能研究.pdfVIP

中文摘要 卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV，又被称为人类第8型疱疹病 Castleman’S 中心性巨大淋巴结增生症(MulticentricDisease)的病因。 体。vGPCR可激活磷脂酶C通路、P13激酶／蛋白激酶等下游信号组 vGPCR基因小鼠可形成类似人类卡波氏肉瘤的病变。本工作组的前 期工作表明，翻译后的调控对于vGPCR的信号传导和致瘤性具有至 关重要的意义。蛋白质的糖基化是在糖基转移酶作用下将糖转移至 蛋白质，和蛋白质上的氨基酸残基形成糖苷键的过程。糖基化是对 蛋白的重要的修饰作用，有调节蛋白质功能作用。本工作组发现 vGPCR具有糖基化修饰作用：在此基础上以HEK293T细胞和Hela 细胞为试验材料，通过vGPCR糖基化突变体构建、免疫荧光分析和 昆虫荧光素报告基因检测等途径对vGPCR的糖基化进行了较为系 统的研究，结果表明糖基化对于vGPCR的细胞内分布和信号传导等 具有至关重要的作用。本论文研究内容和研究结果如下： 1．对vGPCR进行的EndoH蛋白酶切实验结果显示vGPCR具有典 型的糖基化现象，并分析vGPCR在第18位、第22位、第31 饰。 vGPCR及其糖基化突变体重组质粒：只含有第18位、第22位、 第31位或第202位天门冬酰胺的突变体(分别命名为N18、N22、 第202位天门冬酰胺全部突变为谷氨酰胺的突变体(NO)。 3．对vGPCR及其糖基化突变体的蛋白进行了免疫印迹杂交检测， 结果表明vGPCR单个位点突变体和三个位点突变体均具有糖基 ’ 化修饰现象，而NO不具有有糖基化修饰。 4．对vGPCR及其糖基化突变体进行了免疫荧光检测，结果表明 都可以在细胞膜上得到表达而N202Q和NO没有上膜现象。 5．对vGPCR及其糖基化突变体进行了荧光素报告基因实验，实验 不能上调NFAT和NFr,B的表达。 6．制备了含有vGPCR及其糖基化突变体慢病毒，分别用这些慢病 毒侵染NIH3T3细胞，并筛选、建立了稳定表达vGPCR及其糖 基化突变体的NIH3T3细胞系。 综上所述，本研究证明vGPCR具有糖基化修饰，该糖基化修饰 对于vGPCR的信号传导和细胞内分布具有至关重要的作用，为将来 进行体内(invivo)实验、分析检测糖基化在vGPCR的致瘤性中的 功能机制打下了坚实的基础。 关键词：KSHV，vGPCR，糖基化 Il ABSTRACT sarcoma-associated Kaposi’S a that the hasbeen in 8／HHV-8)isgamma-herpesvirusimplicated of human several diseases sarcoma pathogenesis includingKaposi’S effusion a subsetofmulticentric 涨S)，primary lymphoma，and Castleman’Sdisease．KSHVencodedGprotein-coupledreceptor a seventransmembrane canactivate (vGPCR)is receptors．vGPCR C and